質(zhì)粒，小小的身體，大大的能量，對(duì)奮戰(zhàn)在生物實(shí)驗(yàn)室的科研人而言是熟悉的伙伴。科學(xué)的車輪緩緩駛過(guò)，生化實(shí)驗(yàn)室不能失去質(zhì)粒，正如西方不能失去耶路撒冷。

面對(duì)質(zhì)粒，不少科研人心中五味雜陳，幾家歡喜幾家愁，質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)成功皆大歡喜，構(gòu)建失敗輕則耽誤時(shí)間，重則影響畢業(yè)大計(jì)。

而有人則因構(gòu)建質(zhì)粒水平過(guò)于高超，讀博多年歸來(lái)，依然是替全課題組構(gòu)建質(zhì)粒的「工具人」，導(dǎo)師抓住一只羊使勁地薅羊毛，誓要讓其發(fā)光發(fā)熱到最后一分鐘。

來(lái)源：小紅書(shū)

質(zhì)粒構(gòu)建難題頻出，猶如玄學(xué)

學(xué)霸君看完之后，既同情該網(wǎng)友的困境，又暗暗佩服其構(gòu)建質(zhì)粒百發(fā)百中的能力。畢竟，質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)是分子生物學(xué)的技術(shù)難題，被質(zhì)粒折磨得苦不堪言的人不在少數(shù)。

有人半夜輾轉(zhuǎn)難眠，為質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)苦心孤詣，好不容易克服了酶切濃度不夠、轉(zhuǎn)化失敗的困難，又面臨 PCR 之后的條帶暗淡無(wú)光的挑戰(zhàn)。

每一步都嚴(yán)格按照師兄給的步驟嚴(yán)格執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顆粒無(wú)收。

來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)

每一個(gè)不長(zhǎng)菌的培養(yǎng)皿，每一支廢棄的離心管，見(jiàn)證了科研人在努力構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)的茫然無(wú)措與心塞。

來(lái)源：圖蟲(chóng)創(chuàng)意

來(lái)源：圖蟲(chóng)創(chuàng)意

有人欲哭無(wú)淚，給別人構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)百發(fā)百中，給自己構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，換了三個(gè)載體始終得不到想要的結(jié)果。幸運(yùn)是有的，但不多，全部轉(zhuǎn)移給他人了。

來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)

有人花費(fèi)半年的時(shí)間構(gòu)建一個(gè)簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單的質(zhì)粒，卻始終敲不開(kāi)成功的大門，就在最后一次打算放棄時(shí)，隨便挑了三個(gè)菌落測(cè)序，意外地一次性成功。

踏破鐵鞋無(wú)覓處，得來(lái)全不費(fèi)工夫，不得不說(shuō)這是一門玄學(xué)。

來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)

質(zhì)粒構(gòu)建和表達(dá)有絕招，細(xì)節(jié)必不可少

細(xì)節(jié)決定成敗，質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、提取、鑒定、轉(zhuǎn)染、測(cè)定一條龍過(guò)程結(jié)束，嚴(yán)格貫徹「細(xì)節(jié)為先」尤為重要，方能提高實(shí)驗(yàn)成功率。

首先，要熟悉目的質(zhì)粒的構(gòu)造和細(xì)節(jié)，做到有的放矢。世界上有無(wú)數(shù)種質(zhì)粒, 天然存在的、人為改造的 …… 形態(tài)和功能數(shù)不勝數(shù)，讓人眼花繚亂。

但質(zhì)粒就像好比人，再?gòu)?fù)雜的「人」都由「鼻子+眼睛+嘴巴+耳朵」構(gòu)成，換而言之，再?gòu)?fù)雜的質(zhì)粒都由「起始位點(diǎn)+啟動(dòng)子+酶切位點(diǎn)+外源片段」等基本元件構(gòu)成。

學(xué)霸君在此推薦以下方法讓你先人一步掌握質(zhì)粒細(xì)節(jié)：

1. 使用 Vector NTI 軟件，里面含有大量常見(jiàn)和經(jīng)典的質(zhì)粒圖譜，能夠?qū)|(zhì)粒圖譜了解更直觀。

2. 查找質(zhì)粒圖譜的網(wǎng)站，能夠?qū)|(zhì)粒的來(lái)源、構(gòu)造和功能充分掌握。

Addgene 網(wǎng)址：http://www.addgene.org/

來(lái)源：Addgene

  • Vector DB 網(wǎng)址：http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html

  • NCBI 網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

  • 歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) EMBL：http://www.ebi.ac.uk/

其次，需要提醒的是，很多人的實(shí)驗(yàn)止步于提純 DNA 這一步，使得前期工作付諸流水。通常，按得到質(zhì)粒 DNA 的量可將質(zhì)粒抽提方法和試劑盒分為小提，中提，大提。

做實(shí)驗(yàn)嚴(yán)絲合縫地按照步驟執(zhí)行是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w現(xiàn)，但是有時(shí)候也要在不違背主體原則下靈活地改變，例如，在提取質(zhì)粒時(shí)，根據(jù)菌液量、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡刃枰?，靈活地選擇合適的提取方案，才能獲得濃度達(dá)標(biāo)的 DNA，有效快速地推進(jìn)實(shí)驗(yàn)。

畢竟，DNA 濃度直接關(guān)系到酶切、酶連、轉(zhuǎn)化等一系列關(guān)鍵步驟，科研小伙伴不得不提起十二分精神。

來(lái)源：MCE 官網(wǎng)

此外，學(xué)霸君曾受轉(zhuǎn)化步驟困擾，涂菌后的培養(yǎng)皿比臉還干凈。經(jīng)驗(yàn)豐富之后，才知道其中玄機(jī)滿滿。

  • 失敗原因：轉(zhuǎn)化后涂菌太少。

改進(jìn)措施：將搖好的菌離心棄上清, 取沉淀的一半涂板，尤其是構(gòu)建質(zhì)粒時(shí), 也可沉淀全部涂板。

  • 失敗原因：轉(zhuǎn)化后搖菌時(shí)間過(guò)短。

改進(jìn)措施：適當(dāng)增加搖菌時(shí)間，12-14 小時(shí)為佳。

  • 失敗原因：感受態(tài)失效或錯(cuò)誤使用。

改進(jìn)措施：切勿反復(fù)凍融，切勿劇烈振蕩。

  • 失敗原因：抗生素加的比例過(guò)多或過(guò)少, 長(zhǎng)出雜菌。

改進(jìn)措施：細(xì)心認(rèn)真地確認(rèn)抗生素的添加是否正確，設(shè)置對(duì)照組。

東風(fēng)借力，獲得令人安心的質(zhì)粒

質(zhì)粒構(gòu)建看似簡(jiǎn)單，實(shí)則每一步暗含玄機(jī)，稍有不慎，連累整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。之前有研究顯示，近 50% 的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒存在明顯的設(shè)計(jì)缺陷及序列錯(cuò)誤。

東京醫(yī)科牙科大學(xué)某博士因錯(cuò)誤的質(zhì)粒被撤銷了博士學(xué)位，還有人因質(zhì)粒使用不當(dāng)被撤稿。這都是血淚教訓(xùn)！

來(lái)源：東京醫(yī)科牙科大學(xué)官網(wǎng)，撤銷博士學(xué)位聲明

俗話說(shuō)，他山之石，可以攻玉。除了自己努力構(gòu)建質(zhì)粒之外，學(xué)霸君在這里為大家推薦一個(gè)巧妙實(shí)用、事半功倍的方法，為方便迅捷地獲得目的質(zhì)粒保駕護(hù)航。

Addgene 是一個(gè)全球性的、非營(yíng)利性的生物資源儲(chǔ)存庫(kù)，幫助科學(xué)家分享質(zhì)粒的優(yōu)質(zhì)平臺(tái)。它收藏了來(lái)自世界各地的 6109 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的 146411 個(gè)質(zhì)粒，其中包含 895 種即用型病毒載體和 214 種重組抗體。

重要的是，這些質(zhì)粒被來(lái)自 111 個(gè)國(guó)家的科學(xué)家們充分利用，已經(jīng)被請(qǐng)求使用 2128046 次。

來(lái)源：Addgene 官網(wǎng)

此外，該平臺(tái)還提供質(zhì)粒寄存服務(wù)，當(dāng)科學(xué)家發(fā)表研究論文時(shí)，他們可以將相關(guān)的質(zhì)粒寄存在 Addgene，由 Addgene 提供質(zhì)量控制、購(gòu)買資質(zhì)審核，簽署合規(guī)性文件、產(chǎn)品運(yùn)輸和記錄保存等服務(wù)，免去了科研人互相聯(lián)系和郵寄質(zhì)粒的滯后性，將其從繁瑣的事務(wù)中解放出來(lái)。

這些被記錄到科學(xué)論文里的質(zhì)粒們遠(yuǎn)渡重洋，走遍世界，為人類科研事業(yè)的進(jìn)步增磚添瓦。

例如，在平臺(tái)上能看到基因編輯先驅(qū)之一張鋒院士實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)典質(zhì)粒，后面還貼上了文獻(xiàn)來(lái)源 — 在 Science 雜志發(fā)表的研究論文 Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells，令人一目了然，工作效率翻倍。

當(dāng)然，這些質(zhì)粒的使用僅限學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)和非營(yíng)利組織哦，小伙伴們?cè)谑褂迷菏客钯|(zhì)粒時(shí)，也要愛(ài)惜個(gè)人學(xué)術(shù)羽毛，不能隨意用其從事商業(yè)活動(dòng)。

來(lái)源：Addgene 官網(wǎng)

來(lái)源：Addgene 官網(wǎng)

質(zhì)粒構(gòu)建非一朝一夕的功夫，還得仔細(xì)揣摩，愿小伙伴們構(gòu)建一個(gè)成功一個(gè)。大家還有什么經(jīng)驗(yàn)要分享嗎？歡迎在留言區(qū)討論。

題圖來(lái)源：圖蟲(chóng)創(chuàng)意

我們長(zhǎng)期為科研用戶提供前沿資訊、實(shí)驗(yàn)方法、選品推薦等服務(wù)，并且組建了 70 多個(gè)不同領(lǐng)域的專業(yè)交流群，覆蓋神經(jīng)科學(xué)、腫瘤免疫、基因編輯、外泌體、類器官等領(lǐng)域，定期分享實(shí)驗(yàn)干貨、文獻(xiàn)解讀等活動(dòng)。

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