大家都在說 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)原理、引物設(shè)計(jì)、結(jié)果解讀等，而我覺得我應(yīng)該和大家分享一下 qRT-PCR 的實(shí)驗(yàn)操作事項(xiàng)。雖小，但是關(guān)乎結(jié)果。
在做 qRT-PCR 之前，我們需要對(duì)自己的 RNA 以及操作方法有清楚的了解，畢竟我們的努力是希望得到結(jié)果的，而不是簡(jiǎn)單的練練手。所以在做 qRT-PCR 之前，我們需要確定以下問題（部分內(nèi)容僅適用于 SYBR）。
你確定你的 RNA 沒有降解嗎？
NanoDrop 2000 只能檢測(cè) RNA 的濃度以及純度，而對(duì)于 RNA 的完整性是沒法檢測(cè)的。
RNA（RNA Intesity Number）值可以反映 RNA 的完整性，通過 Agilent 2100 Bioanalyzer system 來檢測(cè)
圖. 不同 RNA 樣本的 RIN 值示意圖（真核生物）
但是實(shí)驗(yàn)室一般不會(huì)有 Agilent 2100 Bioanalyzer，在這種情況下，我們可以通過甲醛膠檢測(cè)，但是對(duì) RNA 總量的要求高，那么最快速的方法就是用普通的凝膠電泳。要求在 nuclease-free 的環(huán)境下，所以需要將電泳槽、溶膠瓶、凝膠托槽以及梳子用 DEPC 水沖洗干凈。瓊脂糖也是 nuclease-free（只要是新開封的就行），Loading Buffer 盡可能是新開封的，配置 1.2% 的凝膠。
注意，凝膠一定要保證溶解完全，要不然會(huì)導(dǎo)致條帶不均一。電壓太高或者跑太長(zhǎng)時(shí)間會(huì)產(chǎn)熱，導(dǎo)致 RNA 降解，所以要合理控制電壓和時(shí)間。此外，跑膠也可以進(jìn)一步確定樣品中是否有 DNA 的殘留，觀測(cè)點(diǎn)膠孔是否有大量滯留的條帶。
圖. 凝膠電泳檢測(cè) RNA
你確定你的 cDNA 的濃度嗎？
實(shí)驗(yàn)室大師兄的經(jīng)驗(yàn)是每次反轉(zhuǎn)得到的 20 ul 體系的 cDNA 直接稀釋 20X，而博后師姐是按照 10X 稀釋，我一般是看情況而定。因?yàn)槊總€(gè)人提的 RNA 質(zhì)量不同，反轉(zhuǎn)的水平也分高低，再說反轉(zhuǎn)的技術(shù)也未必穩(wěn)定。
所以在每次拿到反轉(zhuǎn)的 cDNA 后，我首先會(huì)稀釋 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循環(huán)數(shù)一般為 25 cycle，鑒定一下具體濃度，再?zèng)Q定最后的稀釋倍數(shù)。
你確定你的引物好用嗎？
可以通過 qRT-PCR 的溶解曲線，但是呢，這個(gè)還是要耗錢的。對(duì)于沒有很多錢的實(shí)驗(yàn)室來說，在拿到很多引物的時(shí)候，可以通過普通的 RT-PCR 看看是否是單一條帶，鑒定一下引物的特異性。如果實(shí)驗(yàn)室不差錢，則可以通過溶解曲線對(duì)所有的引物的特異性做一次鑒定。
你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎？
如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器，那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因?yàn)椴患嫒莸?PCR 板會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差。因?yàn)槲业膸熃憔驼娴呐龅竭^這種情況。
你確定你的實(shí)驗(yàn)條件合適嗎？
SYBR 要避免強(qiáng)光照射，所以在加 SYBR 試劑的時(shí)候盡量關(guān)掉頭頂?shù)恼彰鳠?，只需借助微光完成就可以?/p>
SYBR 放置 4 ℃ 保存，使用時(shí)輕輕上下顛倒混勻即可，避免泡沫產(chǎn)生，切忌用力渦旋。
有些小師妹怕自己加樣搞混，喜歡在 PCR 板上劃出標(biāo)志，這樣做是不對(duì)的。因?yàn)槟愕臉?biāo)記極有可能影響到熒光信號(hào)的采集，所以一般我會(huì)建議師妹采用實(shí)驗(yàn)記錄本協(xié)助記憶，如下所示。
圖.qRT-PCR 加樣圖
你確定你的操作正確嗎？
一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情說三遍。
為了減少 SYBR 在光下的曝光，個(gè)人喜歡先加入模板， 如下圖。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，少量模板的加入，容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差，我一般會(huì)將樣本再稀釋一倍，加樣的時(shí)候多加一倍，減少 H2O2 的加入量。
圖.qRT-PCR 加樣示意圖
然后配置 qRT-PCR 體系，如下。
圖.qRT-PCR 體系配制圖
注：配置過程需在冰上完成。
加好樣品后，貼好透明封板膜。盡量不要用手碰透明封板膜的表面，從膜兩邊空余處操作就行。因?yàn)槭钟∫灿锌赡芸赡苡绊懙綗晒?a class="keyword-search" >信號(hào)的采集。然后就是用離心機(jī)低速迅速離心 10 S，防止樣本掛壁。
好了，基本的操作部分以及注意事項(xiàng)就這么多，希望能幫到大家。
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