好書推薦！《斑馬魚行為實(shí)驗(yàn)手冊》電子版pdf，網(wǎng)盤發(fā)貨
斑馬魚是一種成熟且廣泛應(yīng)用的發(fā)育遺傳學(xué)模型系統(tǒng)，可利用三選一序列反應(yīng)時(shí)任務(wù)（3-CSRTT）來研究斑馬魚在刺激控制方面的多個(gè)維度。
所有的行為測試都在一個(gè)定制的水箱中進(jìn)行。該水箱由一個(gè)半透明、不反光的丙烯酸材質(zhì)箱體構(gòu)成（高×寬×長：12厘米×12厘米×20厘米），安裝有不透明的隔板，以形成反應(yīng)孔和食物投放區(qū)，并裝有3升水族箱水（注意，水溫保持與飼養(yǎng)水箱中的水溫相同，以盡量減少轉(zhuǎn)移過程中斑馬魚的應(yīng)激反應(yīng)）。刺激物由三個(gè)低電壓黃色發(fā)光二極管（3.4伏）和一個(gè)低電壓綠色發(fā)光二極管（3.4伏）組成，所有這些發(fā)光二極管都使用水族箱密封膠安裝在箱體內(nèi)的防水塑料管中。黃色發(fā)光二極管位于分隔的反應(yīng)孔后方，綠色發(fā)光二極管位于食物投放區(qū)后方。實(shí)驗(yàn)人員可通過一個(gè)開關(guān)盒獨(dú)立控制每個(gè)發(fā)光二極管。測試水箱放置在一個(gè)大型的隔音和遮光的木質(zhì)（中密度纖維板）箱內(nèi)。光線由安裝在箱體頂部的一個(gè)40瓦燈泡提供。一個(gè)攝像頭（微軟網(wǎng)絡(luò)攝像機(jī)）也安裝在箱體頂部，以便對測試水箱中的斑馬魚進(jìn)行持續(xù)的實(shí)時(shí)觀察。刺激燈光、室內(nèi)燈光、食物投放和隔板均由實(shí)驗(yàn)人員在箱體外部操作，以避免測試過程中人類的存在給斑馬魚造成任何應(yīng)激反應(yīng)。斑馬魚會得到少量懸浮在水箱水中的活豐年蝦作為強(qiáng)化物，通過一個(gè)連接在手動微量注射器上的玻璃注射器來投放的。注射器配有一根柔性塑料管（導(dǎo)管管；直徑 = 1毫米），該管延伸到水箱內(nèi)。一次注射3微升的懸浮液可投放約5至10只活豐年蝦，其數(shù)量的任何變化都?xì)w因于豐年蝦在喂食管中的分布情況。每次試驗(yàn)時(shí)都小心確保每只斑馬魚在注射器中的豐年蝦密度相同，從而盡量減少動物之間因強(qiáng)化物水平不同而可能產(chǎn)生的混雜影響，每只斑馬魚都單獨(dú)進(jìn)行測試。
燈光由1個(gè)綠色發(fā)光二極管和3個(gè)黃色發(fā)光二極管（3.4伏）組成，實(shí)驗(yàn)人員可通過位于外部的開關(guān)盒對其進(jìn)行控制。水箱由不透明塑料制成，內(nèi)部隔板和屏障也是如此。這些發(fā)光二極管被插入塑料插件中，并固定在水箱內(nèi)部。測試水箱放置在一個(gè)內(nèi)部裝有照明且襯有聚苯乙烯的木質(zhì)（中密度纖維板）箱內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
習(xí)慣化和定向
所有的斑馬魚都在測試房間內(nèi)適應(yīng)48小時(shí)。所有的訓(xùn)練和測試都在周一至周五（08:30至18:00）進(jìn)行。
在訓(xùn)練的第一天，斑馬魚在測試水箱中適應(yīng)12分鐘。在大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)測試中，最初讓斑馬魚訓(xùn)練20分鐘。然而，發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練10到12分鐘后，斑馬魚的表現(xiàn)確實(shí)會下降（也就是說，斑馬魚出現(xiàn)大量不做出反應(yīng)的情況，并且無法對刺激做出回應(yīng)）。因此，所有的預(yù)訓(xùn)練和訓(xùn)練環(huán)節(jié)都持續(xù)12分鐘。在適應(yīng)階段以及隨后所有的行為訓(xùn)練和測試中，每次測試斑馬魚的順序在各環(huán)節(jié)之間都是隨機(jī)安排的。此外，在每個(gè)環(huán)節(jié)中，斑馬魚都是用網(wǎng)從飼養(yǎng)水箱轉(zhuǎn)移到測試水箱的。在每個(gè)環(huán)節(jié)開始之前，會給斑馬魚2分鐘的時(shí)間來適應(yīng)水箱。在適應(yīng)階段，刺激發(fā)光二極管和食物投放區(qū)的發(fā)光二極管都會亮起，并且屏障始終保持打開狀態(tài)。適應(yīng)階段結(jié)束后，開始進(jìn)行食物投放區(qū)訓(xùn)練。每次試驗(yàn)開始時(shí)都有10秒的試驗(yàn)間隔時(shí)間（ITI），之后食物投放區(qū)的燈光亮起（Sd；綠色發(fā)光二極管），持續(xù)30秒，或者直到斑馬魚進(jìn)入投放區(qū)的孔洞。當(dāng)綠色發(fā)光二極管（Sd）亮起時(shí)，斑馬魚進(jìn)入食物投放區(qū)的行為會得到一次食物獎(jiǎng)勵(lì)。在給予獎(jiǎng)勵(lì)后，綠色發(fā)光二極管（Sd）會熄滅。如果斑馬魚在30秒內(nèi)沒有進(jìn)入食物投放區(qū)，綠色發(fā)光二極管（Sd）就會關(guān)閉，本次試驗(yàn)在沒有獎(jiǎng)勵(lì)的情況下結(jié)束，然后開始試驗(yàn)間隔時(shí)間。這個(gè)過程每個(gè)環(huán)節(jié)持續(xù)12分鐘，并連續(xù)重復(fù)三天（第2天至第4天）。
在食物投放區(qū)訓(xùn)練之后，開始訓(xùn)練斑馬魚接近水箱的反應(yīng)孔洞（第5天至第7天）。所有環(huán)節(jié)都以綠色發(fā)光二極管亮起開始，并且一旦斑馬魚進(jìn)入食物投放區(qū)，第一次試驗(yàn)就開始。就在第一次試驗(yàn)之前，屏障會升起，反應(yīng)孔洞的燈光會同時(shí)亮起。這些燈光會一直亮著，直到斑馬魚進(jìn)入其中一個(gè)孔洞，或者持續(xù)1分鐘，以先發(fā)生的情況為準(zhǔn)。正確進(jìn)入孔洞的行為會通過亮起綠色發(fā)光二極管作為條件性獎(jiǎng)勵(lì)，進(jìn)入食物投放區(qū)的獎(jiǎng)勵(lì)方式和之前一樣。一旦斑馬魚穿過屏障回到食物投放區(qū)，屏障就會降下。所有后續(xù)的試驗(yàn)都在10秒的試驗(yàn)間隔時(shí)間之后開始，在此期間所有的刺激燈光都會熄滅。室內(nèi)燈光在整個(gè)環(huán)節(jié)中始終亮著。所有環(huán)節(jié)持續(xù)12分鐘，或者直到斑馬魚獲得20次獎(jiǎng)勵(lì)為止，記錄每2分鐘內(nèi)獲得獎(jiǎng)勵(lì)的試驗(yàn)次數(shù)。
在預(yù)訓(xùn)練的最后階段（第8天至第9天，屏障會升起，并且其中一個(gè)反應(yīng)孔洞的燈光會亮起。該刺激燈光會一直亮著，直到斑馬魚進(jìn)入正確的孔洞，之后燈光會熄滅，食物投放區(qū)的燈光會亮起，直到斑馬魚進(jìn)入。在訓(xùn)練的所有初始階段會記錄每個(gè)環(huán)節(jié)中獲得的獎(jiǎng)勵(lì)次數(shù)。
三選一序列反應(yīng)時(shí)任務(wù)：
在單燈訓(xùn)練的最后一天之后，開始進(jìn)行三選一序列反應(yīng)時(shí)任務(wù)（3-CSRTT）訓(xùn)練。在這個(gè)任務(wù)版本中，使用了三個(gè)刺激孔洞，這樣做的原因是這個(gè)任務(wù)是全新的，而且之前關(guān)于斑馬魚涉及復(fù)雜空間辨別能力的工具性學(xué)習(xí)的研究非常有限。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，注意到當(dāng)試驗(yàn)間隔時(shí)間、刺激持續(xù)時(shí)間和限時(shí)保持期都為5秒時(shí)，斑馬魚能夠迅速達(dá)到可接受的表現(xiàn)準(zhǔn)確率水平，因此，在任務(wù)訓(xùn)練一開始就采用了這些時(shí)間設(shè)置。此外使用了一個(gè)屏障，在試驗(yàn)間隔時(shí)間之前以及在做出正確或錯(cuò)誤反應(yīng)之后，這個(gè)屏障都會升起和降下。這樣做的原因是，希望確保斑馬魚在試驗(yàn)開始時(shí)能夠看到所有的刺激孔洞（也就是說，屏障能確保它們處于測試水箱的正確區(qū)域），同時(shí)也用來標(biāo)志試驗(yàn)的結(jié)束（在嚙齒動物實(shí)驗(yàn)中，這是通過室內(nèi)燈光來實(shí)現(xiàn)的，但在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對斑馬魚來說，開關(guān)燈光會讓它們產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)）。
3-CSRTT訓(xùn)練持續(xù)9天（每次訓(xùn)練時(shí)長12分鐘）。每次訓(xùn)練開始時(shí)，斑馬魚要在實(shí)驗(yàn)裝置中適應(yīng)5分鐘，之后升起屏障，點(diǎn)亮其中一個(gè)刺激燈光。一旦斑馬魚游進(jìn)亮燈的孔洞，訓(xùn)練環(huán)節(jié)就開始。如果斑馬魚在5分鐘內(nèi)沒有進(jìn)入孔洞，該次訓(xùn)練就會停止，斑馬魚會被放回飼養(yǎng)水箱。如果這種情況連續(xù)出現(xiàn)超過兩次，那么這條斑馬魚將被排除在后續(xù)研究之外。在這之后，升起屏障，開始試驗(yàn)間隔時(shí)間（訓(xùn)練時(shí)為5秒，長試驗(yàn)間隔時(shí)間測試時(shí)為10秒）。在此期間，斑馬魚的任何反應(yīng)都會導(dǎo)致屏障降下（即一旦斑馬魚游回水箱的食物投放區(qū)），并且斑馬魚會受到10秒的暫停懲罰。如果斑馬魚沒有過早進(jìn)入，三個(gè)刺激燈光中的一個(gè)會亮起（偽隨機(jī)順序），持續(xù)5秒，隨后是5秒的限時(shí)保持期（即燈光熄滅，屏障保持打開）。在此期間的任何正確反應(yīng)都會以點(diǎn)亮食物投放區(qū)燈光作為條件性獎(jiǎng)勵(lì)。斑馬魚游回食物投放區(qū)時(shí)會得到一次獎(jiǎng)勵(lì)，并且當(dāng)它游回食物投放區(qū)時(shí)屏障會降下。在投放食物后，在進(jìn)行下一次試驗(yàn)之前必須暫停20秒，這是為了讓斑馬魚有時(shí)間吃掉獎(jiǎng)勵(lì)物。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，獎(jiǎng)勵(lì)后的暫停時(shí)間過短會導(dǎo)致高未反應(yīng)率（即斑馬魚沒有在設(shè)定的時(shí)間限制內(nèi)完成試驗(yàn)）。最后，如果斑馬魚做出錯(cuò)誤反應(yīng)（即進(jìn)入了未亮燈的孔洞），或者在刺激呈現(xiàn)期間或限時(shí)保持期內(nèi)沒有進(jìn)入任何孔洞，該次試驗(yàn)將在沒有獎(jiǎng)勵(lì)的情況下結(jié)束，并且當(dāng)斑馬魚游回食物投放區(qū)后屏障會降下，它會受到10秒的暫停懲罰。
在第18天，通過采用長試驗(yàn)間隔時(shí)間測試來檢測所有斑馬魚的基礎(chǔ)過早反應(yīng)率。在這次測試中，試驗(yàn)間隔時(shí)間延長至10秒，而刺激呈現(xiàn)時(shí)間和限時(shí)保持期仍保持為5秒。在第19天，進(jìn)行一次時(shí)長為5秒試驗(yàn)間隔時(shí)間的單次提醒訓(xùn)練。在第20天，進(jìn)行第一次藥物處理。食物投放和燈光操作由同一位觀察者進(jìn)行。在測試期間，觀察者不知道斑馬魚接受的是何種處理。在第21天，斑馬魚接受第二次提醒訓(xùn)練（即不使用藥物，試驗(yàn)間隔時(shí)間為5秒），最后在第22天，進(jìn)行第二次藥物處理。
在3-CSRTT訓(xùn)練和測試過程中，采用多種行為測量指標(biāo)。這些指標(biāo)包括：
準(zhǔn)確率：計(jì)算方法為 正確反應(yīng)次數(shù)/（正確反應(yīng)次數(shù)+錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)）。
未反應(yīng)率：計(jì)算方法為 未反應(yīng)次數(shù)/（正確反應(yīng)次數(shù)+未反應(yīng)次數(shù)+錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)）。
過早反應(yīng)率：計(jì)算方法為 過早反應(yīng)次數(shù)/（正確反應(yīng)次數(shù)+未反應(yīng)次數(shù)+錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)+過早反應(yīng)次數(shù)）。
參考文獻(xiàn)：
Robbins T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. 2002;163(3):362–80.
Carli M, Robbins T, Evenden J, Everitt B. Effects of lesions to ascending nora-drenergic neurones on performance of a 5-choice serial reaction task in rats; implications for theories of dorsal noradrenergic bundle function based on selective attention and arousal. Behav Brain Res. 1983;9(3):361–80.
Ninkovic J, Folchert A, Makhankov Y, Neuhauss S, Sillaber I, Straehle U, et al. Genetic identification of ache as a positive modulator of addiction to the psychostimulant d-amphetamine in zebrafish. J Neurobiol. 2006;66(5):463–75.
Wood S, Anagnostaras S. Memory and psychostimulants: modulation of Pavlovian fear conditioning by amphetamine. Psychopharmacology. 2009;202(1–3):197–206.
Irons T, MacPhail R, Hunter D, Padilla S. Acute neuroactive drug exposures alter locomotor activity in larval zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 2010;32:84–90.
Parker MO, Millington ME, Combe FJ, Brennan CH. Development and implementation of a three-choice serial reaction time task for zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 2012 Feb 1;227(1):73-80.
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