撰文：nagashi
CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種十分強(qiáng)大的基因編輯工具。近年來，CRISPR技術(shù)通過Cas蛋白靶向基因并對其進(jìn)行定點操作，從而突變或修正靶基因。與此同時，CRISPR技術(shù)還在基因治療、核酸定位以及核酸檢測等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
由此看來，作為一種目前廣泛使用的基因編輯工具，對具有高時空分辨率的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行精確控制是研究基因調(diào)控和編輯的必要條件。
近日，北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室湯新景團(tuán)隊在 Angewandte Chemie 雜志上發(fā)表了題為：Optical Control of a CRISPR/Cas9 System for Gene Editing by Using Photolabile crRNA 的研究論文【1】。
這項研究開發(fā)了一種新型的光控crRNA（向?qū)NA）——通過維生素E和5'末端的光敏基團(tuán)來滅活CRISPR/Cas9系統(tǒng)。維生素E修飾不影響Cas9/crRNA/tracrRNA核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）的形成，但會抑制RNP與靶DNA的相互作用。
通過這一特殊的光控CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)了光誘導(dǎo)的人類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A （VEGFA）基因組編輯，并降低了EGFP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中的EGFP表達(dá)。這種crRNA-caged策略為CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯的時空光調(diào)控提供了新的方法。
究其根源，CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種廣泛存在于原核及古核生物的免疫系統(tǒng)，Cas蛋白具有許多種亞型，其中Cas9蛋白是目前最常用的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)可以攝取外源DNA片段，并將其插入到自身的間隔序列中，新的間隔序列轉(zhuǎn)錄的crRNA引導(dǎo)Cas蛋白特異性切割與之互補(bǔ)的DNA序列。
但值得注意的是，在傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9基因編輯過程中，crRNA引導(dǎo)Cas蛋白在正確的位置與DNA結(jié)合并不是立即發(fā)生的，有時需要幾個小時。這意味著CRISPR-Cas9基因編輯具有延時性。
因此，CRISPR-Cas9基因編輯過程經(jīng)常觀察到不必要的脫靶效應(yīng)。由此可見，對CRISPR-Cas9功能進(jìn)行高時空分辨率的精確控制，有利于減少脫靶效應(yīng)，提高其特異性和作為研究/治療應(yīng)用的強(qiáng)大工具的潛力。
目前，已有一些研究嘗試控制CRISPR-Cas9系統(tǒng)的活性釋放，其中一種常用的方法是通過添加一個阻斷序列，該序列與crRNA的間隔區(qū)雜交，從而阻斷Cas9/crRNA/靶DNA復(fù)合物的形成，然后再以不同的方式打開阻斷序列/間隔序列的雜交區(qū)域，從而恢復(fù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的活性。
在此項研究中，研究人員設(shè)計并構(gòu)建了一個光調(diào)控的新型籠狀CRISPR-Cas9系統(tǒng)——以一種新的、具有5'末端維生素E修飾的光敏crRNA為核心。研究團(tuán)隊首先合成了硝基苯乙二醇和維生素E的亞磷酰胺單體，然后偶聯(lián)到crRNA的5'端，再從固體樹脂中分離得到籠狀crRNA（維生素E-PL-crRNA），然后進(jìn)行進(jìn)一步純化和表征。
光調(diào)節(jié)CRISPR/Cas9誘導(dǎo)DNA編輯的原理圖
實驗結(jié)果證實，在非光照條件下，維生素E修飾能阻斷Cas9/crRNA/tracrRNA/靶DNA復(fù)合物的形成；而在365nm紫外光照射下，維生素E與crRNA的光敏連接被去除，從而恢復(fù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的切割活性。
緊接著，研究人員還評估了籠狀crRNA在不同光照時間下的光敏性，他們發(fā)現(xiàn)在4min的光照射下，維生素E將完全脫離籠狀crRNA。
籠狀crRNA在5'端進(jìn)行維生素E修飾，阻斷Cas9介導(dǎo)的DNA切割
為了進(jìn)一步驗證籠狀crRNA控制CRISPR-Cas9系統(tǒng)的能力，研究人員還進(jìn)行了體外DNA切割實驗：crRNA/tracrRNA/Cas9蛋白1小時裂解靶DNA的效率約為58%，而籠狀crRNA/tracrRNA/Cas9蛋白在相同的時間內(nèi)僅觀察到不到6.6%的靶DNA切割。
這表明維生素E修飾對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的活性有十分明顯的抑制作用。更重要的是，在光照射4min后，觀察到Cas9誘導(dǎo)的靶DNA切割增強(qiáng)了7.6倍，效率恢復(fù)為50.2%，與陽性對照十分接近。
研究團(tuán)隊還探究了籠狀crRNA阻斷CRISPR-Cas9功能的具體機(jī)制。他們研究了Cas9蛋白與crRNA/tracrRNA雙鏈和靶DNA的相互作用，并發(fā)現(xiàn)維生素E修飾不影響Cas9/crRNA/tracrRNA復(fù)合物的形成，但會抑制該復(fù)合物與靶DNA的相互作用。
除此之外，研究人員還在HEK293T細(xì)胞系中驗證了籠狀crRNA控制人類細(xì)胞基因編輯的能力，他們成功實現(xiàn)了光誘導(dǎo)的人類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A （VEGFA）基因組編輯，并降低了EGFP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中的EGFP表達(dá)。
針對HEK293T細(xì)胞VEGFA位點的Cas9/caged crRNA VEGFA/tracrRNA的基因組編輯活性
無獨有偶，今年6月，美國約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員在 Science 雜志上發(fā)表的題為：Very fast CRISPR on demand 的研究論文【2】。也提出了開發(fā)光敏crRNA的研究思路，從而利用光照精確操控基因編輯的時間。
總而言之，湯新景團(tuán)隊的這項研究提供了一種調(diào)控CRISPR-Cas9系統(tǒng)活性的全新開發(fā)思路，并成功在體外切割實驗和人源細(xì)胞系中驗證了其有效性。由此可見，籠狀crRNA的確可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中的基因編輯。
該論文的第一作者張瑜表示：“籠狀crRNA易于固相合成，且與其他核酸修飾相兼容，具有十分良好的應(yīng)用前景，我們的籠狀crRNA-CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需合成不同的籠狀crRNA，就能用于不同的靶點，這比以前報道的誘導(dǎo)性sgRNA更方便?！?/p>
參考文獻(xiàn)：
[1] https://doi.org/10.1002/anie.202009890
[2] https://science.sciencemag.org/content/368/6496/1265
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