質(zhì)粒，小小的身體，大大的能量，對奮戰(zhàn)在生物實驗室的科研人而言是熟悉的伙伴?？茖W(xué)的車輪緩緩駛過，生化實驗室不能失去質(zhì)粒，正如西方不能失去耶路撒冷。

面對質(zhì)粒，不少科研人心中五味雜陳，幾家歡喜幾家愁，質(zhì)粒構(gòu)建表達成功皆大歡喜，構(gòu)建失敗輕則耽誤時間，重則影響畢業(yè)大計。

而有人則因構(gòu)建質(zhì)粒水平過于高超，讀博多年歸來，依然是替全課題組構(gòu)建質(zhì)粒的「工具人」，導(dǎo)師抓住一只羊使勁地薅羊毛，誓要讓其發(fā)光發(fā)熱到最后一分鐘。

來源：小紅書

質(zhì)粒構(gòu)建難題頻出，猶如玄學(xué)

學(xué)霸君看完之后，既同情該網(wǎng)友的困境，又暗暗佩服其構(gòu)建質(zhì)粒百發(fā)百中的能力。畢竟，質(zhì)粒構(gòu)建與表達是分子生物學(xué)的技術(shù)難題，被質(zhì)粒折磨得苦不堪言的人不在少數(shù)。

有人半夜輾轉(zhuǎn)難眠，為質(zhì)粒實驗苦心孤詣，好不容易克服了酶切濃度不夠、轉(zhuǎn)化失敗的困難，又面臨 PCR 之后的條帶暗淡無光的挑戰(zhàn)。

每一步都嚴格按照師兄給的步驟嚴格執(zhí)行，實驗結(jié)果卻顆粒無收。

來源：網(wǎng)絡(luò)

每一個不長菌的培養(yǎng)皿，每一支廢棄的離心管，見證了科研人在努力構(gòu)建質(zhì)粒時的茫然無措與心塞。

來源：圖蟲創(chuàng)意

來源：圖蟲創(chuàng)意

有人欲哭無淚，給別人構(gòu)建重組質(zhì)粒時百發(fā)百中，給自己構(gòu)建質(zhì)粒時，換了三個載體始終得不到想要的結(jié)果。幸運是有的，但不多，全部轉(zhuǎn)移給他人了。

來源：網(wǎng)絡(luò)

有人花費半年的時間構(gòu)建一個簡簡單單的質(zhì)粒，卻始終敲不開成功的大門，就在最后一次打算放棄時，隨便挑了三個菌落測序，意外地一次性成功。

踏破鐵鞋無覓處，得來全不費工夫，不得不說這是一門玄學(xué)。

來源：網(wǎng)絡(luò)

質(zhì)粒構(gòu)建和表達有絕招，細節(jié)必不可少

細節(jié)決定成敗，質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、提取、鑒定、轉(zhuǎn)染、測定一條龍過程結(jié)束，嚴格貫徹「細節(jié)為先」尤為重要，方能提高實驗成功率。

首先，要熟悉目的質(zhì)粒的構(gòu)造和細節(jié)，做到有的放矢。世界上有無數(shù)種質(zhì)粒, 天然存在的、人為改造的 …… 形態(tài)和功能數(shù)不勝數(shù)，讓人眼花繚亂。

但質(zhì)粒就像好比人，再復(fù)雜的「人」都由「鼻子+眼睛+嘴巴+耳朵」構(gòu)成，換而言之，再復(fù)雜的質(zhì)粒都由「起始位點+啟動子+酶切位點+外源片段」等基本元件構(gòu)成。

學(xué)霸君在此推薦以下方法讓你先人一步掌握質(zhì)粒細節(jié)：

1. 使用 Vector NTI 軟件，里面含有大量常見和經(jīng)典的質(zhì)粒圖譜，能夠?qū)|(zhì)粒圖譜了解更直觀。

2. 查找質(zhì)粒圖譜的網(wǎng)站，能夠?qū)|(zhì)粒的來源、構(gòu)造和功能充分掌握。

Addgene 網(wǎng)址：http://www.addgene.org/

來源：Addgene

  • Vector DB 網(wǎng)址：http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html

  • NCBI 網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

  • 歐洲分子生物學(xué)實驗 EMBL：http://www.ebi.ac.uk/

其次，需要提醒的是，很多人的實驗止步于提純 DNA 這一步，使得前期工作付諸流水。通常，按得到質(zhì)粒 DNA 的量可將質(zhì)粒抽提方法和試劑盒分為小提，中提，大提。

做實驗嚴絲合縫地按照步驟執(zhí)行是嚴謹?shù)捏w現(xiàn)，但是有時候也要在不違背主體原則下靈活地改變，例如，在提取質(zhì)粒時，根據(jù)菌液量、實驗?zāi)康牡刃枰?，靈活地選擇合適的提取方案，才能獲得濃度達標的 DNA，有效快速地推進實驗。

畢竟，DNA 濃度直接關(guān)系到酶切、酶連、轉(zhuǎn)化等一系列關(guān)鍵步驟，科研小伙伴不得不提起十二分精神。

來源：MCE 官網(wǎng)

此外，學(xué)霸君曾受轉(zhuǎn)化步驟困擾，涂菌后的培養(yǎng)皿比臉還干凈。經(jīng)驗豐富之后，才知道其中玄機滿滿。

  • 失敗原因：轉(zhuǎn)化后涂菌太少。

改進措施：將搖好的菌離心棄上清, 取沉淀的一半涂板，尤其是構(gòu)建質(zhì)粒時, 也可沉淀全部涂板。

  • 失敗原因：轉(zhuǎn)化后搖菌時間過短。

改進措施：適當增加搖菌時間，12-14 小時為佳。

  • 失敗原因：感受態(tài)失效或錯誤使用。

改進措施：切勿反復(fù)凍融，切勿劇烈振蕩。

  • 失敗原因：抗生素加的比例過多或過少, 長出雜菌。

改進措施：細心認真地確認抗生素的添加是否正確，設(shè)置對照組。

東風(fēng)借力，獲得令人安心的質(zhì)粒

質(zhì)粒構(gòu)建看似簡單，實則每一步暗含玄機，稍有不慎，連累整個實驗進程。之前有研究顯示，近 50% 的實驗室質(zhì)粒存在明顯的設(shè)計缺陷及序列錯誤。

東京醫(yī)科牙科大學(xué)某博士因錯誤的質(zhì)粒被撤銷了博士學(xué)位，還有人因質(zhì)粒使用不當被撤稿。這都是血淚教訓(xùn)！

來源：東京醫(yī)科牙科大學(xué)官網(wǎng)，撤銷博士學(xué)位聲明

俗話說，他山之石，可以攻玉。除了自己努力構(gòu)建質(zhì)粒之外，學(xué)霸君在這里為大家推薦一個巧妙實用、事半功倍的方法，為方便迅捷地獲得目的質(zhì)粒保駕護航。

Addgene 是一個全球性的、非營利性的生物資源儲存庫，幫助科學(xué)家分享質(zhì)粒的優(yōu)質(zhì)平臺。它收藏了來自世界各地的 6109 個實驗室的 146411 個質(zhì)粒，其中包含 895 種即用型病毒載體和 214 種重組抗體。

重要的是，這些質(zhì)粒被來自 111 個國家的科學(xué)家們充分利用，已經(jīng)被請求使用 2128046 次。

來源：Addgene 官網(wǎng)

此外，該平臺還提供質(zhì)粒寄存服務(wù)，當科學(xué)家發(fā)表研究論文時，他們可以將相關(guān)的質(zhì)粒寄存在 Addgene，由 Addgene 提供質(zhì)量控制、購買資質(zhì)審核，簽署合規(guī)性文件、產(chǎn)品運輸和記錄保存等服務(wù)，免去了科研人互相聯(lián)系和郵寄質(zhì)粒的滯后性，將其從繁瑣的事務(wù)中解放出來。

這些被記錄到科學(xué)論文里的質(zhì)粒們遠渡重洋，走遍世界，為人類科研事業(yè)的進步增磚添瓦。

例如，在平臺上能看到基因編輯先驅(qū)之一張鋒院士實驗室的經(jīng)典質(zhì)粒，后面還貼上了文獻來源 — 在 Science 雜志發(fā)表的研究論文 Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells，令人一目了然，工作效率翻倍。

當然，這些質(zhì)粒的使用僅限學(xué)術(shù)機構(gòu)和非營利組織哦，小伙伴們在使用院士同款質(zhì)粒時，也要愛惜個人學(xué)術(shù)羽毛，不能隨意用其從事商業(yè)活動。

來源：Addgene 官網(wǎng)

來源：Addgene 官網(wǎng)

質(zhì)粒構(gòu)建非一朝一夕的功夫，還得仔細揣摩，愿小伙伴們構(gòu)建一個成功一個。大家還有什么經(jīng)驗要分享嗎？歡迎在留言區(qū)討論。

題圖來源：圖蟲創(chuàng)意

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