來(lái)源：好本子
血紅素加氧酶-1 的高表達(dá)水平促進(jìn)巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞中的鐵死亡并加劇斑塊不穩(wěn)定性
圖源：Redox Biology
1、這項(xiàng)研究的目的是 探討參與斑塊進(jìn)展的關(guān)鍵鐵死亡相關(guān)基因（FRG）及其潛在的分子機(jī)制。 通過(guò)生物信息學(xué)分析、單細(xì)胞測(cè)序和免疫組化等表明了巨噬細(xì)胞血紅素加氧酶-1（HMOX1）是參與斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵 FRG；
2、這項(xiàng)研究的 創(chuàng)新之處 在于：①發(fā)現(xiàn)鐵死亡在 MDFCs（巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞）的細(xì)胞毒性中起關(guān)鍵作用，并且是由缺氧應(yīng)激介導(dǎo)的，Hmox1 的高表達(dá)水平誘導(dǎo) MDFCs 鐵死亡并加劇斑塊不穩(wěn)定；②探究了誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞鐵死亡的潛在機(jī)制：在缺氧下由于 Egln3 降解而導(dǎo)致的 Hif1a 穩(wěn)定激活了 MDFCs 中 Hmox1 的轉(zhuǎn)錄，隨后驅(qū)動(dòng)鐵死亡。
研究背景
斑塊破裂伴隨血栓形成是急性心血管事件的主要原因，在此期間，巨噬細(xì)胞死亡是一個(gè)標(biāo)志。鐵死亡是早期和晚期動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有證據(jù)表明巨噬細(xì)胞鐵死亡與斑塊脆弱性有關(guān); 然而，確切的機(jī)制仍然難以捉摸。
研究思路
研究結(jié)果
1. 鑒定巨噬細(xì)胞 HMOX1 是斑塊失穩(wěn)的關(guān)鍵 FRG
為探索斑塊進(jìn)展的潛在機(jī)制，研究者們通過(guò) GSE163154 和 GSE28829 數(shù)據(jù)集分析了穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊之間的差異生物學(xué)特征。從 GSE163154 中鑒定出的 DEGs 主要參與了炎癥反應(yīng)，并激活了鐵死亡途徑。同樣，在易損斑塊中觀察到更大的免疫浸潤(rùn)。進(jìn)一步的單細(xì)胞測(cè)序分析顯示，HMOX1 主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)。免疫組化染色也證實(shí)了在不穩(wěn)定斑塊的巨噬細(xì)胞豐富區(qū)，HMOX1 的表達(dá)增加，并伴有斑塊破裂，脂質(zhì)沉積增加，膠原體積增加?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，假設(shè)低氧應(yīng)激可以誘導(dǎo)亞鐵細(xì)胞 HMOX1 的表達(dá)，隨后激活巨噬細(xì)胞鐵死亡。
圖 1 巨噬細(xì)胞 Hmox1 是參與斑塊失穩(wěn)定的關(guān)鍵 FRG 的鑒定
2. 缺氧可上調(diào) MDFCs 中 Hmox1 的表達(dá)并激活鐵死亡
接下來(lái)通過(guò) GSE16099 數(shù)據(jù)集進(jìn)一步研究了缺氧對(duì)巨噬細(xì)胞的影響。在常氧組和缺氧組之間發(fā)現(xiàn)了 DEGs，在缺氧處理的巨噬細(xì)胞中，HMOX1 的表達(dá)顯著上調(diào)。GO 和 KEGG 的分析結(jié)果如圖 2A 所示。用 ox-LDL 處理 BMDMs，誘導(dǎo) MDFCs，結(jié)果未能觀察到暴露于常氧或低氧條件下的巨噬細(xì)胞中 Hmox1 表達(dá)的差異。然而，在缺氧條件下，MDFCs 中 Hmox1 的表達(dá)水平顯著升高。此外，缺氧抑制了 MDFCs 的活力，但對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)顯著影響。為驗(yàn)證鐵死亡是否在缺氧介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用，研究者們用各種細(xì)胞死亡抑制劑治療 MDFCs。
研究結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡和壞死抑制劑沒(méi)有發(fā)揮保護(hù)作用，而抑制鐵死亡對(duì)缺氧介導(dǎo)的細(xì)胞失活有保護(hù)作用。如圖 2E 所示，缺氧導(dǎo)致 MDFCs 中 GSH/GSSG 比值顯著降低，同時(shí)鐵含量和脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著增加，而這在巨噬細(xì)胞中沒(méi)有觀察到。上述研究結(jié)果表明，鐵死亡在 MDFCs 的細(xì)胞毒性中起著關(guān)鍵作用，并且是由缺氧應(yīng)激介導(dǎo)的。
圖 2 缺氧促進(jìn) MDFCs 中 Hmox1 的表達(dá)并驅(qū)動(dòng)鐵死亡細(xì)胞
3. 高水平的 Hmox1 可促進(jìn) MDFC 的鐵死亡，并加劇斑塊的不穩(wěn)定
用 Hmox1 過(guò)表達(dá)載體（oeHmox1）轉(zhuǎn)導(dǎo)的 MDFCs 顯示 Hmox1 表達(dá)顯著增加，Gpx4 表達(dá)降低。高水平的 Hmox1 誘導(dǎo)鐵死亡細(xì)胞死亡，其特征是 ROS 過(guò)量產(chǎn)生、鐵保留增加和脂質(zhì)過(guò)氧化。此外，由于 HMOX1 與免疫浸潤(rùn)呈正相關(guān)，研究者旨在識(shí)別相關(guān)基因，并探討其潛在的機(jī)制，GSE163154 和 GSE28829 中上調(diào)和下調(diào)的前 20 個(gè)基因如圖 3D 所示。熱圖強(qiáng)調(diào)了 C-C 基序趨化因子配體（CCLs）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的重要性。
相關(guān)分析顯示，HMOX1 與 ccl 和 MMPs 呈正相關(guān)，Hmox1 過(guò)表達(dá)促進(jìn)了 Ccl3、Ccl4、Ccl19 和 Mmp9 的產(chǎn)生。為了研究過(guò)量的 Hmox1 水平是否對(duì)斑塊穩(wěn)定性有害，研究者們使用高劑量的 AAV2/9-F480-m-Hmox1-ZsGreen3 喂養(yǎng) ApoE-/-小鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（AAV-Con）相比，Hmox1 的高表達(dá)加重了頭臂動(dòng)脈的斑塊負(fù)擔(dān)。雖然兩組間膠原體積無(wú)顯著性差異，但 AAV-Hmox1 組的斑塊病變表現(xiàn)為易破裂的特征，脂質(zhì)沉積增加。
圖 3 Hmox1 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致鐵死亡細(xì)胞死亡，并加劇斑塊的不穩(wěn)定性
4. Hif1a 在 Egln3 降解條件下的穩(wěn)定促進(jìn)了 Hmox1 的轉(zhuǎn)錄
接下來(lái)對(duì)暴露于缺氧的 MDFCs 中進(jìn)行了 RNA-seq，并將 Egln3 鑒定為候選基因。GSEA 一致顯示，在缺氧處理的 MDFCs 中，HIF-1 信號(hào)通路和鐵死亡通路被激活。Western 結(jié)果顯示缺氧條件下 Egln3 表達(dá)降低，Hif1a 和 Hmox1 活性增加。同樣，Egln3 沉默通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡促進(jìn)細(xì)胞內(nèi) Hif1a 的積累，并上調(diào) Hmox1 的表達(dá)。為了了解 HIF1A 影響 HMOX1 表達(dá)的機(jī)制，用 HIF1A pcDNA3.1 和 HMOX1 啟動(dòng)子-報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞。
結(jié)果表明，HIF1A 增強(qiáng)了 2000 bp、1500 bp、1300 bp、1000 bp 和 100 bp 啟動(dòng)子的活性，表明 HIF1A 的結(jié)合位點(diǎn)可能位于 HMOX1 啟動(dòng)子區(qū)域的 100 bp 范圍內(nèi)。該結(jié)合位點(diǎn)的突變顯著抑制了 HIF1A 激活的熒光素酶活性。Hif1a 與 Hmox1 啟動(dòng)子的直接結(jié)合也通過(guò) ChIP 分析驗(yàn)證了。
圖 4 缺氧誘導(dǎo)因子（Hif）1a 在 Egln3 降解條件下的穩(wěn)定促進(jìn)了 Hmox1 的轉(zhuǎn)錄
文章小結(jié)
總之，這項(xiàng)研究結(jié)果表明了：①Hmox1 的作用是水平依賴(lài)性的，Hmox1 的過(guò)度藥理學(xué)誘導(dǎo)會(huì)驅(qū)動(dòng) MDFCs 中的鐵死亡氧化應(yīng)激；②缺氧條件誘導(dǎo) MDFCs 中的 Hmox1 過(guò)表達(dá)，這加劇了鐵死亡細(xì)胞死亡并影響了斑塊穩(wěn)定性；③Egln3 降解介導(dǎo)的 Hif1a 穩(wěn)定化增加了 Hmox1 活性；④高 Hmox1 表達(dá)水平對(duì) MDFCs 活力和噬菌斑穩(wěn)定性有害，為動(dòng)脈粥樣硬化的管理提供了參考。
本文及圖片來(lái)源于好本子，作者轉(zhuǎn)載
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