腫瘤患者及家屬對病理報告應(yīng)該很是熟悉，但是病理報告是怎么出來的，具體有什么用，還不是很清楚。
今天，小編就跟大家深度講一講病理診斷。
病理診斷指通過手術(shù)切除、內(nèi)鏡活檢、細針穿刺等方式獲取人體組織或細胞，借助顯微鏡等工具對樣本進行一系列處理和觀察，研究疾病病因、發(fā)病機制、形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和代謝等方面的改變，揭示疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而闡明疾病本質(zhì)的醫(yī)學(xué)科學(xué)，是絕大部分疾病，尤其是腫瘤疾病的診斷“金標準”。
病理診斷流程主要包含取樣、制片、診斷、報告四個步驟。
根據(jù)樣本類型可分為組織學(xué)檢查、細胞學(xué)檢查兩類。
二者取樣方式并不相同，組織學(xué)樣本一般通過開放手術(shù)、內(nèi)鏡檢查或經(jīng)皮穿刺活檢獲取，而細胞學(xué)樣本一般通過體液、拉網(wǎng)、細針穿刺、脫落細胞等途徑獲取。
組織學(xué)檢查和細胞學(xué)檢查是病理診斷的兩類基本方式，通常稱為組織病理和細胞病理，主要進行的是形態(tài)學(xué)觀察。
通過分別與免疫診斷、分子診斷相結(jié)合，病理診斷形成了另外兩個重要分支：免疫病理和分子病理，將病理診斷從組織、細胞水平的形態(tài)學(xué)觀察深入到蛋白與分子水平。
一
組織病理
組織學(xué)檢查一般可分為石蠟切片和術(shù)中冰凍切片兩種制片方式，二者應(yīng)用場景不同，各有優(yōu)劣。
石蠟切片應(yīng)用最為廣泛，但制片過程較為繁瑣，耗時較長，一般需要3-5天才能出具結(jié)果，但清晰度較高，并且可以長期保存使用；
冰凍切片一般用于手術(shù)中快速診斷，通過低溫將組織快速冷卻硬化，僅需半小時左右即可 出具診斷結(jié)果，但制片質(zhì)量不如石蠟切片，存在一定誤診率，對病理醫(yī)師要求較高。
根據(jù)2009年《病理科建設(shè)與管理指南（試行》要求，出具一般病理診斷報告的醫(yī)師需具備初級以上病理學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，且經(jīng)過病理診斷專業(yè)知識培訓(xùn)或?qū)？七M修學(xué)習(xí)1-3 年，而快速病理診斷醫(yī)師應(yīng)當具有中級以上病理學(xué)專業(yè)技術(shù)任職資格，并有5年以上病理閱片診斷經(jīng)歷。
HE染色為最常見、最基本的切片染色方法，其中蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。
二
細胞病理
目前，細胞病理常用制片技術(shù)分為巴氏涂片及液基薄層細胞學(xué)制片技術(shù)。
巴氏涂片法利用刮板從宮頸處刮取脫落細胞，然后直接在玻片上涂抹，進而完成固定、染色。由于巴氏涂片存在細胞丟失、制片質(zhì)量差等問題，其逐步被液基薄層細胞學(xué)制片方式替代；液基薄層細胞學(xué)制片主要可分為膜式制片（ TCT ）、沉降式制片（ LCT/LBP）兩類，一般習(xí)慣統(tǒng)稱為TCT，不做具體區(qū)分。
TCT：利用將宮頸脫落細胞洗入細胞保存液瓶中，刮片毛刷在小瓶內(nèi)攪拌，通過高精密度過濾膜過濾將標本中的雜質(zhì)分離，取濾后的上皮細胞制成直徑為20 mm薄層細胞于載玻片上，而后進行固定、染色、封片。
LCT/LBP：采用兩次離心及獨立染色，在自動化、標準化等方面具有較大優(yōu)勢，可以實現(xiàn)對病理診斷質(zhì)量的良好控制，目前已成為我國主流細胞學(xué)制片方式。除主要應(yīng)用于宮頸細胞學(xué)檢測以外，在痰、胸腹水、尿液、肺泡灌洗液等非婦科樣本檢測方面更具優(yōu)勢。
三
免疫組化病理
免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry, IHC）指利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合原理和標記于抗體上的顯色劑（酶、熒光素、同位素、 金屬離子等），對組織內(nèi)特定抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測。IHC具有特異性強、敏感性高、定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合等特點，有利于病理學(xué)領(lǐng)域的深入研究，在現(xiàn)代病理診斷中起重要作用。
相關(guān)術(shù)語還包括免疫細胞化學(xué)（Immunocytochemistry, ICC）和免疫熒光（Immunofluorescence, IF），IHC、ICC指通過標記酶進行顯色，臨床上一般統(tǒng)稱為IHC，不作嚴格區(qū)分；
IF利用熒光素而非酶來進行顯色，有時也稱為熒光法IHC。
IF是最早建立的免疫組織學(xué)技術(shù)。將已知抗體標上熒光素，以此作為探針，檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原。當抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會發(fā)出一定波長的熒光，從而對組織中的抗原進行定位或定量，需配合使用熒光顯微鏡進行觀察。
IHC/ICC技術(shù)出現(xiàn)在IF之后，目前在臨床上應(yīng)用最為廣泛。IHC/ICC先以酶標抗體作用于組織或細胞，然后加入底物，在酶的催化下 生成有色的不溶性物質(zhì)，從而對細胞內(nèi)抗原進行定位，只需使用普通光學(xué)顯微鏡即可進行觀察。
免疫組化在病理診斷工作中應(yīng)用廣泛，可提供蛋白表達層面的客觀證據(jù)，在腫瘤良惡性判斷、確定腫瘤細胞來源、鑒別診斷腫瘤類型或亞型、腫瘤分化方向、腫瘤分級、預(yù)后判斷、靶向治療、微小轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)和確定等方向有廣泛應(yīng)用。
對于感染性疾病，通過免疫組化技術(shù)識別特定的細菌、病毒等微生物，提高感染性疾病病理診斷的準確性。
此外，免疫組化還能用于靶向藥物腫瘤靶標的測定、腫瘤化學(xué)性藥物治療反應(yīng)的預(yù)測以及腫瘤預(yù)后判斷的綜合性評估，達到和實現(xiàn)伴隨診斷意義。
免疫組化病理：染色制片過程
1. 烤片：將帶有蠟的組織切片黏在載玻片上，以免染色過程中切片脫落 ；
2. 脫蠟和水化：通過二甲苯進行脫蠟，然后使用下行梯度乙醇將組織中二甲苯替代出來 ；
3. 抗原修復(fù)：部分抗原肽鏈經(jīng)過此前步驟處理后發(fā)生扭曲，無法在免疫組化染色過程中顯示，因而需利用化學(xué)試劑或熱作用將被封閉抗原重 新暴露 ；
4. 細胞膜打孔：使用脂溶性試劑將細胞膜穿孔，增加細胞膜對抗體的滲 透性（檢測細胞膜抗原時可免去此步驟） ；
5. 滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素：防止底物H202分解，DAB沉淀 ；
6. 非免疫血清封閉：利用與二抗種屬相同的非免疫血清封閉電荷，阻止一抗與之結(jié)合，抑制非特異性背景著色，防止抗體被組織切片中富有電荷的膠原和結(jié)締組織成分吸附 ；
7. 一抗孵育：按照推薦濃度做梯度稀釋，確定最適濃度 ；
8. 二抗孵育：加入選擇與一抗種屬匹配的二抗進行孵育 ；
9. 顯色：滴加顯色劑，一般選用DAB或AEC ；
10. 復(fù)染：使用蘇木精等普通染料對切片進行復(fù)染，使切片清晰顯示組織結(jié)構(gòu)，便于準確定位 ；
11. 封片；
免疫組化病理：檢測及顯色系統(tǒng)
免疫組化染色中使用的抗體主要分為一抗、二抗。
一抗是可與抗原特異性結(jié)合的抗體。一抗種類包括單克隆抗體和多克隆抗體，主要作用在于識別出試驗所需檢測的物質(zhì)；
二抗可與一抗特異性結(jié)合，即抗體的抗體。二抗針對某一 特定物種產(chǎn)生的所有抗體均具有特異性，二抗上通常標記 酶、熒光基團等物質(zhì)用于后續(xù)顯色或發(fā)光。二抗的作用在 于檢測一抗的存在、放大一抗的信號。
根據(jù)是否選用二抗以及二抗標記物類型可形成多種不同的 檢測系統(tǒng)，目前生物素法以及酶標聚合物法使用較為廣泛。
顯色系統(tǒng)：亦包含多種類型，其中HRP-DAB應(yīng)用最為廣 泛。
免疫組化病理：臨床應(yīng)用（以NSCLC為例）
免疫組化技術(shù)廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的診斷，以非小細胞肺癌（NSCLC）為例，NSCLC占所有肺癌的 80%，可以分為不同的組織學(xué)類型， 主要包括腺癌（≥ 40%）和鱗癌（30%），以及較為少見的大細胞癌（LCC）（10%）。隨著肺腺癌和鱗癌個體化治療方案的日趨不同，臨床強烈要求對不同組織學(xué)類型的 NSCLC 進行明確診斷。
四
分子病理
分子診斷是應(yīng)用分子生物學(xué)方法，通過檢測受檢個體或其攜帶病毒、病原體的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或含量的變化而做出診 斷的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。
分子病理則是將分子診斷技術(shù)應(yīng)用于病理診斷中，以組織學(xué)/細胞學(xué)標本為載體，從基因水平上檢測細胞和組織的分子遺傳學(xué)變化，以協(xié)助病理診斷和分型、指導(dǎo)靶向治療、預(yù)測治療反應(yīng)及判斷預(yù)后。
目前分子病理技術(shù)路線主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、熒光原位雜交（FISH）以及高通量測序（NGS），不同技 術(shù)路線各有優(yōu)劣，其中PCR與FISH技術(shù)平臺發(fā)展相對較為成熟。
分子病理：技術(shù)路線——PCR
聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。
自上世紀80年代問世至今，PCR技術(shù)已經(jīng)迭代至第三代：
第一代定性PCR：通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分析，分析僅停留在定性或半定量層面，且檢測時間長、有交叉感染風(fēng)險。
第二代qPCR（實時熒光定量PCR）：在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線實現(xiàn)定量分析，數(shù)據(jù)采集可在PCR擴增過程中完成。
第三代dPCR（數(shù)字PCR）：基于芯片式液滴微流控技術(shù)，將一個樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行 PCR 擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析，可以對實現(xiàn)絕對定量檢測。
分子病理：qPCR技術(shù)延伸-突變擴增阻滯系統(tǒng)（ARMS）
ARMS技術(shù)：在反應(yīng)體系內(nèi)加入針對檢測目標的“突變型”引物，利用野生型核酸模板不能與“突變型”引物的3’端堿 基互補配對而無法被Taq酶延伸的原理，實現(xiàn)對野生型核酸模板的擴增阻滯。而突變型核酸模板能夠與“突變型”引物 的3’端堿基互補配對，通過PCR反應(yīng)放大“突變”信號并最終被qPCR儀檢測出來。
利用ARMS技術(shù)合并熒光探針，在實時熒光PCR平臺上對樣本DNA進行一個或多個位點的基因突變檢測，是目前應(yīng)用 最成熟、臨床應(yīng)用最廣泛的技術(shù)平臺。該技術(shù)優(yōu)點包括：
（1）檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細胞中突變比例為1%甚至更 低的突變基因；
（2）適用于片段化DNA，利于開展分子病理診斷（由于甲醛的固定處理，石蠟包埋標本組織的DNA 大部分片段化）；
（3）結(jié)合qPCR實現(xiàn)閉管操作，可減少污染的可能性。
分子病理：技術(shù)路線——FISH
熒光原位雜交（FISH）是依據(jù)堿基互補原理，應(yīng)用熒光素直接或間接標記的核酸探針，在組織切片、細胞涂片、染色體鋪片上檢測間期細胞核染色質(zhì)數(shù)量及結(jié)構(gòu)變化，進行定性和相對定量的分析檢測技術(shù)。由于DNA分子在染色體上沿縱軸呈線性排列，因此可以使用探針直接與染色體進行雜交從而在染色體上定位特定的基因。通過用半抗原標記DNA或RNA探針與目標序列互補配對，通過帶有熒光基團的抗體識別半抗原進行檢測， 或直接用熒光基團對探針進行標記并與目標序列結(jié)合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察目標序列在細胞核、染色體或切片組織中的分布情況。
優(yōu)點：可多種熒光標記，顯示 DNA 片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確；靈敏、特異性好，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型。
缺點：不能達到100%雜交，在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降；對操作和判讀技術(shù)要求較高；成本昂貴、通量低。
分子病理：技術(shù)路線——NGS
高通量測序（NGS）是繼Sanger 測序的革命性進步，指通過模板DNA分子的化學(xué)修飾，將其錨定在納米孔或微載體芯片上，利用堿基互補配對原理，在DNA聚合酶鏈反應(yīng)或DNA連接酶反應(yīng)過程中，通過采集熒光標記信號或化學(xué)反應(yīng)信號，實現(xiàn)堿基序列的解讀。
NGS可以進行大規(guī)模平行測序，每次運行可同時對數(shù)百萬個片段進行測序，提高速度和精確度，同時測序成本大幅降低。
以上就是關(guān)于病理診斷技術(shù)基礎(chǔ)的介紹與應(yīng)用。
文章來源：e藥安全
聲明：本公眾號旨在幫助醫(yī)療衛(wèi)生專業(yè)人士更好地了解相關(guān)疾病領(lǐng)域最新進展，傳遞更多信息之目的，不能以任何方式取代專業(yè)的醫(yī)療指導(dǎo)，也不應(yīng)被視為診療建議。若信息被用于了解資訊以外的目的，本平臺及作者不承擔(dān)相關(guān)責(zé)任。同時，本公眾號所有文章系出于且注明來源和作者，不希望被轉(zhuǎn)載的媒體可文末留言聯(lián)系，我們將盡快進行刪除處理。
熱門跟貼