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近年腫瘤血管生成領(lǐng)域的研究不斷深入，成為國家自然科學基金的熱點話題。今天，我們將以一個 2023 年成功獲批的腫瘤血管生成研究項目為例，為大家詳細解析國自然申請書的撰寫技巧。

中標項目：LGALS1/CD276/STAT3 促進腫瘤血管生成介導膀胱癌進展的機制和功能研究

一、項目研究思路分析

LGALS1：LGALS1 是一種蛋白，全稱為半乳糖結(jié)合凝集素 1（Galectin-1）。它是一種 β-半乳糖結(jié)合的凝集素，能夠通過與多種細胞表面的糖結(jié)合，參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、黏附和細胞間信號傳遞等過程。在腫瘤中，LGALS1 通常被過表達，并與腫瘤的免疫逃逸、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成等多個方面有關(guān)，它可以促進腫瘤的進展。

CD276：CD276（B7-H3）是 B7 家族成員之一，是一種免疫檢查點分子，通常在多種類型的腫瘤細胞表面表達。它的表達與腫瘤的免疫逃避、增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CD276 通過與免疫系統(tǒng)中的受體相互作用，可以促進腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，進而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

STAT3：信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3），是 STAT 蛋白家族的成員之一，參與細胞生長、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等多個重要生物過程。在多種腫瘤中，STAT3 的持續(xù)激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它可以促進細胞的無限增殖、抑制凋亡、促進血管生成和炎癥反應(yīng)，從而有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

腫瘤血管生成：是指腫瘤內(nèi)部新血管的形成過程，這是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤通過分泌血管生成因子（如 VEGF）等分子，促進周圍正常血管向腫瘤組織內(nèi)生長，為腫瘤提供養(yǎng)分和氧氣，同時也為腫瘤細胞的擴散提供了通道。

在本項目中，LGALS1、CD276、STAT3 這三個分子可能形成一個或多個信號傳遞路徑，促進腫瘤血管生成和膀胱癌的進展。這些信號軸的具體調(diào)控機制可能涉及上述分子相互之間的直接或間接相互作用，以及它們與其他信號分子的相互作用，共同影響腫瘤的微環(huán)境，促進腫瘤血管的形成和腫瘤細胞的增殖、生存和遷移。

本項目的思路大致為：LGALS1、CD276 和 STAT3 通過相互作用和信號傳遞，促進腫瘤血管生成，導致膀胱癌的進展。

二、項目寫作（穿插寫作思路講解）

摘要

摘要撰寫時注意其包括以下幾個部分：

（1）疾病研究的問題（提出問題）；

（2）目前研究熱點（問題切入）；

（3）預(yù)實驗數(shù)據(jù)（提出假設(shè)的依據(jù)）；

（4）提出假設(shè)（根據(jù)研究熱點和預(yù)實驗數(shù)據(jù)，提出自己的科學假說，一句話）；

（5）擬進行研究（研究內(nèi)容的縮寫，打算怎么證明或驗證假設(shè)）；

（6）研究意義。同時撰寫時嚴格把控字符數(shù)（400）

根據(jù)以上幾個要素，這里我們的摘要可以寫為：

膀胱癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，由于其高復發(fā)率和死亡率，迫切需要新型治療策略。目前，關(guān)于 LGALS1/CD276/STAT3 軸在膀胱癌血管生成中的作用及其機制研究仍然有限。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，LGALS1、CD276 和 STAT3 在膀胱癌組織中高表達，并且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。進一步的實驗表明，這三種分子能夠促進膀胱癌細胞的血管生成。因此，我們提出科學假說：LGALS1/CD276/STAT3 軸通過促進腫瘤血管生成導致膀胱癌進展。為驗證這一假設(shè)，我們計劃在組織樣本水平、體內(nèi)、體外和分子水平，利用免疫組化、小鼠異種移植模型、細胞培養(yǎng)和基因敲除等技術(shù)，明確 LGALS1/CD276/STAT3 軸的功能作用，闡釋其促進膀胱癌血管生成的作用機制，評價其在膀胱癌治療中的應(yīng)用潛力。此研究有望揭示 LGALS1/CD276/STAT3 軸在膀胱癌進展中的關(guān)鍵作用，為開發(fā)新型膀胱癌治療策略提供理論依據(jù)。

（一）立項依據(jù)

1．項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析，需結(jié)合科學研究發(fā)展趨勢來論述科學意義；或結(jié)合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。附主要參考文獻目錄）；

立項依據(jù)的撰寫主要包括幾個部分：

你要研究什么？即臨床問題
研究的意義是什么？
目前的國內(nèi)外研究有哪些缺陷，哪些問題，從何處入手？
我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)了什么，即預(yù)實驗，為什么我來研究這個問題最合適以及為何產(chǎn)生此假說？即闡明假說形成的思路過程。
凝練出本課題的關(guān)鍵科學問題，提出「研究假說」。簡要說明你的研究思路。

國自然基金重在科學假說的創(chuàng)新性、合理性、明確性、邏輯性、科學性、完善性，缺一不可。但是點到為止，既要證明該假說的合理，又不能把所有的實驗都做完，是一個拼圖游戲，所以這里面分子機制的實驗數(shù)據(jù)列舉需要有個度，預(yù)實驗達到總研究內(nèi)容的 30% 左右為宜。

在撰寫立項依據(jù)時，參考文獻也需要注意以下幾點：

1. 選擇權(quán)威和有影響力的文獻；2. 引用最新的研究成果：近 3 年，不可引用太老的文章，且需引用幾篇申請當年發(fā)表的文獻；3 引用適量的文獻：在立項依據(jù)中，不要過度引用文獻，也不要過于依賴文獻堆砌，青年、地區(qū) 30 篇左右，面上 40 篇左右即可。

在這里，我們可以寫做：

1.1 研究意義：揭示新型治療靶點對抗膀胱癌進展的重要性

這一部分應(yīng)當介紹為什么研究膀胱癌的新型治療靶點是重要的?？梢杂懻摪螂装┑牧餍胁W數(shù)據(jù)，目前的治療方法以及它們的局限性，從而強調(diào)開發(fā)新治療方法的迫切需要和潛在影響。

1.2 LGALS1/CD276/STAT3 軸的高表達與膀胱癌患者預(yù)后負相關(guān)

在這部分，應(yīng)詳細介紹 LGALS1、CD276 和 STAT3 三個基因/蛋白在膀胱癌中的表達情況以及它們?nèi)绾闻c患者的預(yù)后相關(guān)聯(lián)?？梢酝ㄟ^回顧相關(guān)文獻和研究，展示這一軸線如何影響膀胱癌患者的生存率和疾病進展。

1.3 LGALS1/CD276/STAT3 軸促進膀胱癌細胞血管生成

這部分應(yīng)聚焦于如何 LGALS1/CD276/STAT3 軸通過促進血管生成來影響膀胱癌的發(fā)展?？梢蕴接戇@一信號通路的生物學機制，以及它如何促進腫瘤微環(huán)境中的血管形成，進而支持腫瘤生長和擴散。

1.4 腫瘤血管生成增強促進膀胱癌進展

這一節(jié)應(yīng)詳細闡述腫瘤血管生成（即血管新生）對于膀胱癌進展的作用。介紹血管新生的生物學基礎(chǔ)，如何為腫瘤提供必需的養(yǎng)分和氧氣，以及這如何與膀胱癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)聯(lián)。

1.5 本項目的科學假說和后續(xù)研究計劃

最后一部分應(yīng)提出本研究的科學假說，并詳細描述后續(xù)的研究計劃。包括預(yù)計采用的實驗設(shè)計、預(yù)期結(jié)果及其對膀胱癌治療可能產(chǎn)生的影響。此外，還應(yīng)該討論假設(shè)驗證的方法，如果假設(shè)成立，可能對治療膀胱癌的策略帶來哪些新的見解。

（二）研究目標

研究目標的撰寫注意以下幾點：

①目標清晰，層次分明，只寫目標，不用再重復研究意義、用什么方法研究，且目標具體，可實現(xiàn)。

② 突出科學性。

③內(nèi)容詳盡，覆蓋到所有的擬解決的科學問題。

可按照明確 …… 關(guān)系；揭示 …… 規(guī)律；理解 …… 作用；闡明 …… 機制等的模板撰寫

以本項目為例，研究目標可寫做：

1. 明確 LGALS1/CD276/STAT3 信號軸在膀胱癌中的表達關(guān)系及其與疾病嚴重程度之間的相關(guān)性。

2. 揭示 LGALS1/CD276/STAT3 軸促進腫瘤血管生成的分子機制和信號通路。

3. 理解 LGALS1/CD276/STAT3 信號軸在膀胱癌進展中的整體作用及其作為治療靶點的潛力。

（三）研究內(nèi)容

研究內(nèi)容的撰寫需注意是為了達成研究目標而要去做的研究，與研究目標呼應(yīng)，為具體研究方案的框架，撰寫過程中可按照臨床樣本、動物水平、細胞水平分層次撰寫，闡明做什么事達成什么目的。同時明確細胞、動物模型的選擇和構(gòu)建。

那么，該如何撰寫呢？我們這里以圖文的形式為大家展現(xiàn)（注意，這里的配圖僅是為了大家直觀地理解研究內(nèi)容的寫作，并非是技術(shù)路線圖，實際的標書中研究內(nèi)容部分并不需要該圖）

1、臨床研究

在本研究的臨床部分，將收集 100 例膀胱癌患者的新鮮腫瘤組織樣本及相應(yīng)非腫瘤對照組織。通過免疫組化（IHC）和免疫熒光技術(shù)，檢測 LGALS1、CD276 和 STAT3 蛋白的表達，評估它們在膀胱癌組織中的定位和表達水平。此外，將使用流式細胞術(shù)分析腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的組成，尤其是 T 細胞和巨噬細胞的亞群，探究免疫微環(huán)境與腫瘤進展的關(guān)系。通過定量 PCR 和 Western blot 進一步驗證 LGALS1、CD276 和 STAT3 的 mRNA 和蛋白水平，以及它們在腫瘤進展中的表達動態(tài)。

2、動物研究

使用 NOD-SCID 小鼠，通過尾靜脈注射 T24 或 5637 膀胱癌細胞株構(gòu)建膀胱癌模型。動物分為四組：對照組、敲除 LGALS1 組、敲除 CD276 組以及 STAT3 敲除組。應(yīng)用 CRISPR/Cas9 技術(shù)進行基因編輯。將通過免疫組化分析血管內(nèi)皮細胞標志物 CD31 和平滑肌肌動蛋白 α-SMA 來定量血管生成和腫瘤間質(zhì)變化，使用超聲成像技術(shù)評估腫瘤大小及血流情況，為評估腫瘤血管生成提供直觀的生理信息。通過 EdU 增殖檢測評估細胞增殖活性。通過 TUNEL 檢測評估細胞凋亡。通過 HE 染色評估組織形態(tài)，通過染色組織切片觀察腫瘤的細胞結(jié)構(gòu)和組織構(gòu)造。計算腫瘤體積，通過定期測量腫瘤的三維尺寸估算其體積，以評估腫瘤生長的速度和模式。

3、細胞研究

選擇 T24、5637 和 UM-UC-3 膀胱癌細胞系進行細胞實驗，分為：對照組、LGALS1 敲除組、CD276 敲除組、STAT3 敲除組以及挽救實驗組：LGALS1 敲除后 CD276 過表達組及 CD276 敲除后 STAT3 過表達組。利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除基因，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)恢復基因表達。細胞功能實驗包括 CCK-8 細胞增殖實驗、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，以及實時細胞分析儀（RTCA）評估細胞遷移和侵襲能力。此外，通過 Matrigel 基質(zhì)膠進行管型形成實驗，結(jié)合 VEGF 和 bFGF 的 ELISA 分析，全面評估細胞的血管生成能力。

4、分子機制研究

利用 RNA 干擾技術(shù)（RNAi）、CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)精確調(diào)控 LGALS1、CD276 和 STAT3 的表達，并結(jié)合定點突變技術(shù)探討這些因子在膀胱癌中的作用。特別關(guān)注它們?nèi)绾瓮ㄟ^促進血管生成和腫瘤細胞的增殖來影響膀胱癌的進展。使用質(zhì)譜分析檢測蛋白質(zhì)的修飾和相互作用，理解信號傳導途徑的動態(tài)變化和調(diào)控機制。ChIP-seq 分析研究蛋白-DNA 相互作用，尤其是轉(zhuǎn)錄因子如 STAT3 在基因表達調(diào)控中的作用。單細胞 RNA 測序分析細胞異質(zhì)性和基因表達，提供對腫瘤細胞群體內(nèi)部復雜性的深入視角。通過大數(shù)據(jù)分析識別關(guān)鍵的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，評估它們在腫瘤進展中的作用。

（四）擬解決的科學問題

關(guān)鍵科學問題的撰寫需要凝練出本項目的重點難點問題，同時與研究目標、研究內(nèi)容相呼應(yīng)，使得研究目標就是去解決這個問題，而研究內(nèi)容就是解決這個問題的方式。撰寫中在提出科學問題之后還要解釋一下為什么這是關(guān)鍵科學問題；并給出解決方案，如何去解決這個問題。

在青年、地區(qū)項目中，關(guān)鍵科學問題通常寫 2 個即可，面上則撰寫 3 個為宜。

具體如何撰寫呢？

1. 明確 LGALS1/CD276/STAT3 軸在促進腫瘤血管生成中的具體功能是本項目擬解決的關(guān)鍵科學問題之一。

這一問題的關(guān)鍵性在于，盡管已知該信號軸與膀胱癌進展相關(guān)，但其在腫瘤血管生成中的確切作用及作用機制尚未清晰。本項目擬通過細胞功能實驗（如管型形成、遷移和侵襲實驗）、動物模型（如裸鼠異種移植模型）和免疫組織化學分析，證實 LGALS1/CD276/STAT3 軸對腫瘤血管生成的促進作用。

2. 闡明 LGALS1/CD276/STAT3 軸促進腫瘤血管生成的分子機制是本項目擬解決的關(guān)鍵科學問題之二。

解析這一機制對于揭示膀胱癌發(fā)展的新機理和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點至關(guān)重要。本項目擬通過實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）、Western blot 分析和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，探?LGALS1/CD276/STAT3 軸在細胞內(nèi)的信號傳遞路徑和關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。

3. 揭示 LGALS1/CD276/STAT3 軸作為膀胱癌治療新靶點的潛力是本項目擬解決的關(guān)鍵科學問題之三。

鑒于膀胱癌治療的迫切需求，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點具有重要的臨床意義。本項目擬通過藥物敏感性測試（細胞存活率實驗）、基因敲除或過表達后的動物模型研究，以及免疫組織化學評估治療后腫瘤組織的血管密度變化，評估靶向 LGALS1/CD276/STAT3 軸的治療干預(yù)對腫瘤血管生成和膀胱癌進展的影響，證實其作為治療靶點的應(yīng)用潛力。

2024 年度國自然醫(yī)學部 50 大科研熱點中標數(shù)統(tǒng)計如下：