近日，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果實品質(zhì)與保鮮團隊聯(lián)合華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和新西蘭植物與食品研究所等單位，在Plant Biotechnology Journal發(fā)表了題為“Spatial regulation of chlorophyll degradation in kiwifruit: AcNAC2-AcSGR1/2 cascades mediate rapid de-greening in the inner pericarp”的研究論文。該研究揭示了AcNAC2-AcSGR1/2級聯(lián)模塊調(diào)控獼猴桃內(nèi)果肉快速褪綠的分子機制，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)突變關(guān)鍵NAC基因獲得褪綠延遲型獼猴桃。該研究為通過遺傳手段改良獼猴桃果肉色澤品質(zhì)，選育快速褪綠獼猴桃種質(zhì)資源提供了關(guān)鍵分子靶標(biāo)。
色澤是果實品質(zhì)分級的重要指標(biāo)之一，果皮色澤的變化是番茄、香蕉、葡萄等眾多果實成熟的重要生理標(biāo)志。然而，獼猴桃果實由褐色果皮包被，其果實色澤主要體現(xiàn)在果肉組織。特別是在黃肉、紅心等獼猴桃品種中，果肉完全褪綠是決定其商品價值的核心要素。前期研究表明，葉綠素降解是獼猴桃果肉褪綠的必經(jīng)過程，對于類胡蘿卜素和花青素等呈色物質(zhì)的展現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用。因此，研究獼猴桃果實葉綠素降解的生物學(xué)機制是果實色澤品質(zhì)改良的重要一環(huán)，也是實現(xiàn)不同色澤果實育種的重要基礎(chǔ)。
該研究在時空維度系統(tǒng)分析了黃肉紅心獼猴桃“紅陽”果實發(fā)育過程中內(nèi)/外果肉相關(guān)色素指標(biāo)的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)內(nèi)果肉的葉綠素降解速率明顯快于外果肉。由于內(nèi)外果肉來自同一個果實，可確保發(fā)育階段的一致性，是挖掘葉綠素降解調(diào)控基因的理想試材。利用轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合基因表達驗證和酶活性分析，獲得2個在內(nèi)果肉顯著上調(diào)表達的葉綠素降解關(guān)鍵基因AcSGR1和AcSGR2。通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)AcSGR1/2的表達水平與9個候選差異轉(zhuǎn)錄因子均高度相關(guān)。后續(xù)煙草雙熒光素酶和EMSA實驗進一步證實，NAC轉(zhuǎn)錄因子AcNAC2能夠直接結(jié)合AcSGR1和AcSGR2的啟動子，顯著激活其表達（圖1）。熒光定量PCR結(jié)果顯示，相較于外果肉，AcNAC2在內(nèi)果肉更早表達且表達量更高。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，AcNAC2與AcNAC3高度同源，推測可能存在功能冗余。利用煙草雙熒光素酶，發(fā)現(xiàn)AcNAC3能夠微弱地激活A(yù)cSGR1和AcSGR2的表達，激活效應(yīng)大約為1.5-1.6倍。以上結(jié)果說明，NAC家族成員在調(diào)控SGR基因表達方面可能存在一定的保守效應(yīng)，其中AcNAC2可能發(fā)揮著主效作用。
圖1 AcNAC2正向調(diào)控葉綠素降解關(guān)鍵基因AcSGR1/2啟動子
為探究AcNAC2的生物學(xué)功能，該研究在獼猴桃中穩(wěn)定過表達AcNAC2并獲得3個過表達株系（AcNAC2#23，#43，#45；圖2）。與野生型（WT）相比，3個過表達株系均呈現(xiàn)明顯的黃化表型。隨后熒光定量PCR結(jié)果表明，AcNAC2的過表達能夠顯著誘導(dǎo)下游靶基因AcSGR1和AcSGR2的表達。
圖2 AcNAC2在獼猴桃中穩(wěn)定過表達分析
由于AcNAC2的過表達株系在后期繼代培養(yǎng)中表現(xiàn)出致死的表型，無法獲得生根植株進行后續(xù)研究。為進一步證實AcNAC2和AcNAC3在獼猴桃果實褪綠中的貢獻，該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制了早花的nac2nac3雙突變體植株（#173和#180）（圖3）。與野生型（WT）果實相比，突變體果實的果肉褪綠進程明顯延緩，且色度角和葉綠素含量則顯著升高。相較于WT果實，AcNAC2和AcNAC3以及下游靶基因AcSGR1和AcSGR2在突變體果實中的表達豐度也均顯著降低。綜上，該研究通過獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)合分子生物學(xué)手段，揭示了獼猴桃不同果肉組織葉綠素差異代謝的關(guān)鍵NAC-SGR級聯(lián)調(diào)控通路，為不同色澤果實育種提供分子靶標(biāo)。
圖3 nac2nac3雙突變體果實色澤表型及相關(guān)基因表達分析
安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院為該論文的第一單位，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后吳瑩瑩和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生劉金鳳為論文共同第一作者，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)殷學(xué)仁教授、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)曾云流副教授和新西蘭植物與食品研究所高級科學(xué)家Niels J. Nieuwenhuizen為論文共同通訊作者。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院23級本科生盛心源、王文球教授、汪松虎教授，新西蘭植物與食品研究所Andrew C. Allan院士、高級科學(xué)家Ross G. Atkinson、Marcela Martinez-Sanchez、王天池研究員，四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院涂美艷研究員和浙江大學(xué)博士研究生鄧佳慧等參與了相關(guān)研究。
本論文研究得到了安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后科學(xué)基金（03087003）、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才基金（rc322302）、浙江省自然科學(xué)基金（LZ23C150001）、四川省果樹育種專項（2021YFYZ0023-01）、浙江省育種專項（2021C02066-8）、國家自然科學(xué)基金（32272779）、湖北省重點研發(fā)計劃（2023BBB064）、中國農(nóng)業(yè)科研體系專項基金（CARS-26）、新西蘭商業(yè)、創(chuàng)新和就業(yè)部以及部分來自獼猴桃品種和特許權(quán)使用費收入的PFR內(nèi)部資金等項目的資助。劉金鳳的新西蘭訪學(xué)由中國留學(xué)基金管理委員會資助。
來源：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
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