沙門氏菌（
Salmonella）屬于革蘭氏陰性菌，分布廣泛，可以在動(dòng)植物體內(nèi)和環(huán)境中生存繁殖。通過侵襲腸上皮細(xì)胞、分泌毒力因子，從而擾亂宿主機(jī)體正常代謝功能。為防止由沙門氏菌引起的食源性感染，向肉類、蛋類食品中添加食品防腐劑是一重要舉措。天然防腐劑主要包括以植物提取物、精油等為主的植物源防腐劑，以抗菌酶、抗菌肽等為代表的動(dòng)物源防腐劑，以及細(xì)菌素等微生物源防腐劑。
抗菌肽（AMPs）作為一類具有抗菌活性的小分子肽，大小通常為15～50 個(gè)氨基酸殘基，最大不超過150 個(gè)氨基酸殘基。 根據(jù)抗菌肽的來源不同，大體可以將其分為昆蟲抗菌肽、動(dòng)物抗菌肽、微生物基因工程表達(dá)抗菌肽和化學(xué)合成抗菌肽。其中，昆蟲抗菌肽具有很好的抗菌活性以及更低的毒性，使其 成為開發(fā)天然抗菌劑的研究熱點(diǎn)。LL-1是基于對(duì)桃蛀螟（
Conogethes punctiferalis）轉(zhuǎn)錄測序分析獲得的新型抗菌肽，屬天蠶素抗菌肽。前期研究發(fā)現(xiàn)，LL-1對(duì)肺炎克雷伯菌（
Klebsiella pneumoniae）有良好的抗菌作用，能夠通過影響肺炎克雷伯菌細(xì)胞膜通透性和結(jié)合脫氧核糖核酸（DNA）等多種機(jī)制達(dá)到抗菌效果。
安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院的王宇航、連凱琪*，河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院的馬增軍*等主要探究LL-1對(duì)沙門氏菌的抗菌作用機(jī)制，以期為后續(xù)深入研究提供一定的參考依
1 LL-1對(duì)沙門氏菌的MIC
根據(jù)刃天青指示劑的特性，如圖1所示，PBS陰性對(duì)照組有細(xì)菌生長；卡那霉素陽性對(duì)照組細(xì)菌完全被抑制生長，處理組均在第6孔顏色發(fā)生變化，所以LL-1對(duì)沙門氏菌的MIC為第5孔對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，即6.25 μg/mL。
2 LL-1對(duì)沙門氏菌生長的影響
如圖2所示，在0～12 h內(nèi)，與陰性對(duì)照組相比，1 MIC的LL-1對(duì)沙門氏菌的抑制效果明顯，當(dāng)LL-1質(zhì)量濃度到達(dá)4 MIC時(shí)抑制作用最強(qiáng)，能完全抑制細(xì)菌的生長。
3 LL-1對(duì)沙門氏菌形態(tài)的影響
與對(duì)照組（圖 3 A ）相比，經(jīng) L L-1 處理組（圖 3B 、 C ）中，細(xì)菌呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞壁皺縮、破裂，菌體間黏連。
透射電子顯微鏡下，與對(duì)照組（圖4A）相比，經(jīng)LL-1處理組（圖4B、C）中，沙門氏菌在LL-1的作用下，菌體表現(xiàn)空泡化，細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞膜模糊甚至溶解，胞內(nèi)容物外泄，細(xì)胞質(zhì)電子云密度降低。
紅色箭頭指示菌體空泡化；藍(lán)色箭頭指示細(xì)胞膜溶解；黑色箭頭指示質(zhì)壁分離；紅色三角形指示細(xì)胞質(zhì)電子云密度降低。
由此可見，LL-1可以通過影響沙門氏菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致沙門氏菌出現(xiàn)破裂，致使其內(nèi)容物外泄。
4 LL-1對(duì)沙門氏菌細(xì)胞膜完整性的影響
如圖5所示，經(jīng)LL-1處理過的沙門氏菌與陰性對(duì)照組相比上清液中的核酸、蛋白質(zhì)含量顯著增高，且核酸、蛋白質(zhì)泄漏量隨著LL-1質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長而增多。這說明LL-1對(duì)沙門氏菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用，且破壞作用具有時(shí)間和濃度依賴性。
5 LL-1對(duì)沙門氏菌細(xì)胞壁通透性的影響
如圖6所示，經(jīng)LL-1處理后的沙門氏菌上清液中ALP的濃度增加，與陰性對(duì)照組相比，質(zhì)量濃度為1 MIC的LL-1能使沙門氏菌ALP泄漏量顯著增加，說明LL-1能使沙門氏菌細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)。
6 PI染色實(shí)驗(yàn)
如圖7所示，經(jīng)LL-1處理過的沙門氏菌熒光強(qiáng)度顯著高于0 MIC陰性對(duì)照組，且隨著LL-1質(zhì)量濃度的升高熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)。說明LL-1能夠破壞沙門氏菌的細(xì)胞膜，使PI進(jìn)入胞內(nèi)與DNA結(jié)合。
7 LL-1與沙門氏菌DNA結(jié)合能力
如圖8所示，當(dāng)LL-1與沙門氏菌的質(zhì)量比值達(dá)到2.5時(shí)，條帶變暗，但加樣孔變亮，且隨著質(zhì)量比值的增加越來越亮。說明LL-1能夠與沙門氏菌DNA結(jié)合，且隨著LL-1比例的增加結(jié)合能力越強(qiáng)。
8 LL-1對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)SDH活性的影響
由圖9可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)LL-1處理后的沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)的SDH活性顯著降低，并隨著質(zhì)量濃度的增加SDH活性降低，說明LL-1能通過抑制沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)SDH活性影響細(xì)菌能量代謝。
9 LL-1對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)NADP-MDH活性的影響
由圖 10 可知，與對(duì)照組相比，經(jīng) LL-1 處理后的沙門氏菌胞內(nèi) NADP-MDH 活性顯著降低，進(jìn)一步說明 LL-1 能影響細(xì)菌能量代謝。
10 LL-1對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)ATP的影響
如圖11所示，經(jīng)LL-1處理的沙門氏菌與對(duì)照組相比，胞內(nèi)ATP含量顯著降低，且隨著LL-1質(zhì)量濃度的增加，ATP含量越來越低。這說明LL-1能夠通過降低胞內(nèi)ATP含量影響細(xì)菌能量代謝，從而發(fā)揮抑制作用。
沙門氏菌是最常見的食源性病原菌之一，可通過污染肉類和蛋類，引發(fā)沙門氏菌感染。為有效抑制沙門氏菌在食品上的附著，添加食物防腐劑是最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。從健康的角度出發(fā)，化學(xué)防腐劑由于其本身毒性原因，在使用時(shí)受到多種限制。因此，來源于植物、動(dòng)物和微生物的次生代謝產(chǎn)物的天然抗菌劑受到了更多的關(guān)注。昆蟲抗菌肽憑借其低細(xì)胞毒性、高抗菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，為天然食品防腐劑的開發(fā)提供了方向。
目前，抗菌肽在臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)領(lǐng)域已受到廣泛關(guān)注，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用還較少。筆者前期研究了LL-1對(duì)肺炎克雷伯菌的抗菌機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其能通過增加肺炎克雷伯菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的通透性，并且與DNA發(fā)生結(jié)合，從而抑制肺炎克雷伯菌的生長繁殖。但LL-1對(duì)沙門氏菌的抗菌效果和機(jī)制尚不清楚。本研究旨在評(píng)價(jià)LL-1對(duì)沙門氏菌的抗菌活性，并初步探求LL-1對(duì)沙門氏菌的作用機(jī)制。首先通過測定MIC和抗菌曲線評(píng)價(jià)了LL-1的抗菌活性，結(jié)果表明與肺炎克雷伯菌相比，LL-1對(duì)沙門氏菌有更強(qiáng)的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被LL-1處理過的沙門氏菌上清液中的核酸、蛋白質(zhì)含量升高，且具有時(shí)間和濃度依賴性，說明LL-1破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜，造成核酸、蛋白質(zhì)泄漏（圖12）。ALP位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間，當(dāng)細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)時(shí)，ALP會(huì)發(fā)生泄漏，可用ALP泄漏量反映細(xì)胞壁破損的程度。邢晨通過檢測雷公藤紅素陽離子脂質(zhì)體與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）共培養(yǎng)物中ALP的濃度，證實(shí)了雷公藤紅素陽離子脂質(zhì)體能破壞MRSA細(xì)胞壁完整性，達(dá)到抗菌目的。本實(shí)驗(yàn)同樣檢測到LL-1使沙門氏菌ALP發(fā)生泄漏，說明其破壞了沙門氏菌細(xì)胞壁完整性。PI是一種核酸染料，能夠與DNA結(jié)合發(fā)出熒光，但PI不能穿過完整的細(xì)胞膜。楊智源等通過PI染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗菌肽DB16作用過的金黃色葡萄球菌熒光強(qiáng)度增加。本實(shí)驗(yàn)中，被LL-1處理的沙門氏菌經(jīng)PI染色后，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，進(jìn)一步說明LL-1能夠破壞沙門氏菌的細(xì)胞膜。此外，有研究表明，凡納濱對(duì)蝦抗菌肽PV13不僅能夠改變副溶血性弧菌細(xì)胞膜的通透性，還能夠與細(xì)胞內(nèi)部分子DNA發(fā)生結(jié)合，達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著LL-1與沙門氏菌DNA質(zhì)量比值升高，條帶越來越暗，說明LL-1與沙門氏菌DNA發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而可能影響后續(xù)RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯過程。這與前期研究中，LL-1對(duì)肺炎克雷伯菌抗菌機(jī)制結(jié)果相似，推測LL-1可能主要通過破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的完整性，結(jié)合菌內(nèi)DNA等作用于革蘭氏陰性菌。能量代謝對(duì)生物體內(nèi)各種生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)起著至關(guān)重要的作用，SDH嵌合于細(xì)胞內(nèi)膜，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，在一定程度上可作為評(píng)價(jià)三羧酸循環(huán)程度的指標(biāo)。MDH是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，連接多條代謝途徑，其活性對(duì)細(xì)菌能量代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)和活性氧代謝起著至關(guān)重要的作用。ATP來源于糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑，其含量的高低反映細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)情況，ATP的含量降低會(huì)影響細(xì)菌的基本生命活動(dòng)，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長繁殖。有研究結(jié)果表明，抗菌肽P-1能夠降低粉紅單端孢（Trichothecium roseum）中的ATP含量、SDH和MDH活性，從而抑制細(xì)菌的能量代謝來殺滅細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)中被LL-1處理過的沙門氏菌，胞內(nèi)SDH及NADPMDH活性出現(xiàn)顯著降低，反映三羧酸循環(huán)程度降低，導(dǎo)致了ATP的生成減少。同時(shí)，胞內(nèi)ATP含量降低的另一原因也可能是細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，胞內(nèi)ATP發(fā)生泄漏。LL-1對(duì)沙門氏菌抗菌機(jī)制總結(jié)見圖12，關(guān)于LL-1作用于細(xì)胞膜、細(xì)胞壁以及能量代謝通路的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
紅色向上箭頭表示上升或增加；藍(lán)色向下箭頭表示下降或減少；虛線表示可能存在的過程；本圖繪制于Figdraw。
結(jié) 論
LL-1對(duì)沙門氏菌具有良好的抗菌效果，在形態(tài)上使細(xì)胞發(fā)生皺縮，能破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致沙門氏菌胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等重要物質(zhì)泄漏，還可以與DNA結(jié)合影響復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的合成，影響SDH和NADP-MDH的活性，以及降低ATP的含量?？傊?，LL-1通過增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性、影響胞內(nèi)大分子和阻礙能量代謝等方式影響沙門氏菌的生存和繁殖。
作者簡介
通信作者：
馬增軍 教授
博士生導(dǎo)師，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任。全國優(yōu)秀教師，河北省政府特殊津貼專家，河北省高校百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才，河北省“三三三人才工程”二層次人選。兼任中國微生物學(xué)會(huì)獸醫(yī)專業(yè)委員會(huì)委員，中國農(nóng)學(xué)會(huì)特產(chǎn)分會(huì)常務(wù)理事，河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)生物安全與減抗增效崗位專家。長期從事病原微生物病原學(xué)與臨床防控研究。多次主持承擔(dān)國家及河北省自然基金、科技攻關(guān)及星火項(xiàng)目，取得科研成果20余項(xiàng)，獲省市級(jí)獎(jiǎng)勵(lì)10余項(xiàng)，出版《動(dòng)物微生物學(xué)》《人及動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)》等教材及著作10余部，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表論文100余篇。
連凱琪 副教授
安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院
2010年本科畢業(yè)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015年博士畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2016年至今任職于安陽工學(xué)院。河南省教育廳學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人，安陽市青年科技專家，雙師雙能型教師。主要從事抗菌藥物開發(fā)與抗菌機(jī)制研究，主持國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題、河南省科技攻關(guān)、河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研、安陽市重大科技專項(xiàng)等項(xiàng)目10余項(xiàng)。第一或通信作者發(fā)表SCI和核心期刊論文20余篇。第一發(fā)明人授權(quán)國家發(fā)明專利3 項(xiàng)。
第一作者：
王宇航 碩士研究生
安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院
安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生，2019年本科畢業(yè)于安陽工學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，目前就讀于河北科技師范學(xué)院獸醫(yī)專業(yè)，與安陽工學(xué)院聯(lián)合培養(yǎng)。研究方向?yàn)榭咕目咕鷻C(jī)制研究。
本文《 抗菌肽LL-1對(duì)沙門氏菌的抗菌機(jī)制》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第4期110-116頁，作者： 王宇航，周玲玲，周瑤玲，撒俊夢(mèng)，張?jiān)迹R增軍 *，連凱琪*。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20240602-002.http://www.spkx.net.cn。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。
實(shí)習(xí)編輯：申婧婧；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)。
為深入探討未來食品在大食物觀框架下的創(chuàng)新發(fā)展機(jī)遇與挑戰(zhàn)，促進(jìn)產(chǎn)學(xué)研用各界的交流合作，由北京食品科學(xué)研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監(jiān)督管理總局技術(shù)創(chuàng)新中心（動(dòng)物替代蛋白）及中國食品雜志社《食品科學(xué)》雜志、《Food Science and Human Wellness》雜志、《Journal of Future Foods》雜志主辦，西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院、四川旅游學(xué)院烹飪與食品科學(xué)工程學(xué)院、四川輕化工大學(xué)食品與釀酒工程學(xué)院、成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院、成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所、四川大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院、西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院、宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院、大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京聯(lián)合大學(xué)保健食品功能檢測中心共同主辦的“第二屆大食物觀·未來食品科技創(chuàng)新國際研討會(huì)”即將于2025年5月24-25日在中國 四川 成都召開。
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為進(jìn)一步深入探討食品產(chǎn)業(yè)在當(dāng)前復(fù)雜多變環(huán)境下的高質(zhì)量發(fā)展路徑，并著重關(guān)注食品科學(xué)、營養(yǎng)安全保障的基礎(chǔ)研究與關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)，貫徹落實(shí)“大食物觀”和“健康中國2030”國家戰(zhàn)略，北京食品科學(xué)研究院和中國食品雜志社《食品科學(xué)》雜志、《Food Science and Human Wellness》雜志、《Journal of Future Foods》雜志，將與國際谷物科技協(xié)會(huì)（ICC）、湖南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)、湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中南林業(yè)科技大學(xué)、長沙理工大學(xué)、湘潭大學(xué)、湖南中醫(yī)藥大學(xué)、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長沙現(xiàn)代食品創(chuàng)新研究院共同舉辦“第十二屆食品科學(xué)國際年會(huì)”。本屆年會(huì)將于2025年8月9-10日在中國 湖南 長沙召開。
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