口服給藥具有無創(chuàng)性，是一種理想的給藥途徑，但對于許多類型的化合物仍不可行。如果靶點(diǎn)在腸道內(nèi)，該藥物必須能夠在上消化道（GIT）的酸性和蛋白水解條件下生存，并可能被微生物蛋白酶降解。這使得口服生物藥物具有挑戰(zhàn)性。
噬菌體（phages）是一種原核病毒，以在感染過程中將宿主機(jī)制導(dǎo)向噬菌體編碼基因的表達(dá)而聞名。本研究提出一個(gè)假設(shè)，即一種治療性蛋白可以被編碼到一個(gè)毒性噬菌體中，從而在一個(gè)常駐腸道細(xì)菌感染過程中與噬菌體基因共表達(dá)，然后通過噬菌體誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解釋放到細(xì)胞外。此外，還假設(shè)噬菌體-細(xì)菌的共存將導(dǎo)致噬菌體編碼基因的持續(xù)產(chǎn)生。
在此，弗吉尼亞理工學(xué)院Bryan B. Hsu和Liwu Li證明了基因工程毒性噬菌體可以用來重新編程細(xì)菌來表達(dá)和釋放治療性蛋白。相關(guān)研究內(nèi)容以“Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage”為題發(fā)表在《Nature Biotechnology》。首先，本研究證明了當(dāng)超折疊綠色熒光蛋白（sfGFP）基因在宿主細(xì)菌和噬菌體的基因組中被編碼時(shí)，強(qiáng)毒性噬菌體T4將大量細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光標(biāo)記蛋白sfGFP釋放到培養(yǎng)裂解液中。然后，通過小鼠模型表明，單劑量編碼sfGFP基因的噬菌體可以在小鼠黏膜中大量原位產(chǎn)生sfGFP。最后，在兩個(gè)小鼠模型中證明了本研究提出的方法的可行性。
在第一個(gè)模型中，使用T4噬菌體表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑B1a（serpin B1a）蛋白抑制促炎酶中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）的活性，該酶在結(jié)腸炎過程中上調(diào)。在第二個(gè)模型中，使用T4噬菌體表達(dá)蛋白ClpB，蛋白ClpB具有一個(gè)不連續(xù)的5個(gè)氨基酸基序，與厭食神經(jīng)肽α-促黑激素（α-MSH）同源，可以誘導(dǎo)飽腹感以減少肥胖期間的體重增加。研究發(fā)現(xiàn)，在飲食誘導(dǎo)肥胖（DIO）小鼠模型中，設(shè)計(jì)表達(dá)ClpB的T4噬菌體可以減少體重增加?？傊?，本研究表明，毒性噬菌體可以用來表達(dá)和釋放對哺乳動(dòng)物宿主具有生理作用的異源蛋白。
研究內(nèi)容
如圖1a所示，假設(shè)細(xì)菌被一個(gè)強(qiáng)毒性噬菌體感染會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。將T4噬菌體與表達(dá)sfGFP基因的大腸桿菌K-12菌株孵育。在后文中用“sfgfp”表示該基因，用“sfGFP”表示sfgfp基因的蛋白產(chǎn)物。如圖1b所示，與不含噬菌體培養(yǎng)的細(xì)菌（~7×103 AU/OD）相比，含T4噬菌體的熒光大腸桿菌培養(yǎng)物在上清液中每個(gè)細(xì)胞有更多的熒光（~0.5-1.0×106AU/OD）。以上數(shù)據(jù)表明T4噬菌體促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白釋放到細(xì)胞外。
圖1 噬菌體誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)
接下來量化在細(xì)菌細(xì)胞感染過程中是否可以產(chǎn)生并釋放大量噬菌體編碼的異源蛋白。早期T4噬菌體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄優(yōu)于宿主啟動(dòng)子，部分原因是前者啟動(dòng)子強(qiáng)度更大，宿主RNA聚合酶修飾優(yōu)先轉(zhuǎn)錄T4啟動(dòng)子。這最終導(dǎo)致噬菌體啟動(dòng)子在連續(xù)階段的轉(zhuǎn)錄（圖2a），以優(yōu)化活病毒顆粒的組裝。本研究生成一個(gè)重組T4噬菌體小文庫，其中包含驅(qū)動(dòng)sfgfp基因表達(dá)的選定啟動(dòng)子（圖2b），并將該結(jié)構(gòu)插入一個(gè)已用于T4重組的非必要假設(shè)膜蛋白（ac基因）中。在大腸桿菌K-12中培養(yǎng)12 h后，用熒光法測定上清液中釋放的sfGFP蛋白。與缺乏sfgfp基因的非工程T4噬菌體（野生型）相比，缺乏啟動(dòng)子（無啟動(dòng)子）或使用強(qiáng)組成型大腸桿菌啟動(dòng)子（J23119）并沒有導(dǎo)致更多的sfGFP熒光（圖2c）。與野生型T4噬菌體相比，編碼這些啟動(dòng)子的噬菌體滴度降低大約兩倍，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2d）?；谧畲髎fGFP水平和對噬菌體滴度影響最小的標(biāo)準(zhǔn)，在接下來的實(shí)驗(yàn)中使用gp22啟動(dòng)子。
圖2 T4噬菌體啟動(dòng)子對體外生產(chǎn)sfGFP的研究
如圖3a所示，在飲用水中提供鏈霉素，用單劑量的大腸桿菌定植，然后給予野生型T4噬菌體或T4：：sfgfp噬菌體。細(xì)菌和噬菌體共定植4天后，發(fā)現(xiàn)兩者都大量存在（圖3b）。熒光顯微鏡對未固定腸切片黏膜的熒光定量顯示，T4：：sfgfp噬菌體定植的小鼠比野生型T4噬菌體定植的小鼠的GFP熒光顯著增加（圖3c）。由于自身熒光，野生型T4噬菌體具有低水平熒光，而T4：：sfgfp噬菌體具有大量粘膜熒光（圖3d、e）。為進(jìn)一步驗(yàn)證GFP熒光定位于粘膜，固定腸道樣本，用WGA和UEA I對DAPI和粘蛋白進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，野生型T4噬菌體定植小鼠黏膜中的FITC通道熒光與組織的自身熒光相比沒有明顯變化（圖3f）。在更高的放大倍數(shù)下，通道分離（圖3g-j）。相比之下，用T4：：sfgfp噬菌體定植的小鼠有大量的黏膜GFP熒光（圖3k）。更高的放大倍數(shù)（圖3l）證實(shí)GFP熒光（圖3m）增加，共定位于組織管腔側(cè)的粘膜（圖3n），遠(yuǎn)離細(xì)胞核（圖3o）。綜上結(jié)果表明，由噬菌體特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的異源基因在噬菌體繁殖過程中可以大量表達(dá)。
圖3 通過工程噬菌體在體內(nèi)產(chǎn)生sfGFP
為了檢測T4：：serpin噬菌體產(chǎn)生的serpin在哺乳動(dòng)物腸道中的有效性，使用化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型（圖4a）。如圖4b、c所示，糞便中的大腸桿菌和噬菌體水平在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)存在，而野生型T4和T4：：serpin之間沒有顯著差異。第9天T4：：serpin處理的小鼠體重顯著增加（圖4d），且糞便NE活性顯著降低（圖4e）。對結(jié)腸中性粒細(xì)胞的分析顯示，不同噬菌體條件下的中性粒細(xì)胞密度相似（圖4f），但來自T4：：serpin處理小鼠的中性粒細(xì)胞富含CD24標(biāo)記物（圖4g）。
圖4 通過Serpin的產(chǎn)生減弱DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎
為了確定基于噬菌體方法原位產(chǎn)生ClpB是否會(huì)對宿主產(chǎn)生生理相關(guān)的影響，使用如圖5a所示的DIO小鼠模型。糞便噬菌體滴度顯示，野生型T4和T4：：clpB噬菌體均能在小鼠腸道中保持定植（圖5b）。盡管引入了野生型T4或T4：：clpB噬菌體（圖5c），糞便大腸桿菌濃度也顯示出持續(xù)的定植（圖5c），突出噬菌體和細(xì)菌之間的共存。為深入了解觀察到的噬菌體和細(xì)菌共存的潛在機(jī)制，將糞便大腸桿菌菌落與噬菌體進(jìn)行交叉雜交，以確定噬菌體抗性的頻率。如圖5d、e所示，與野生型T4培養(yǎng)的大腸桿菌相比，T4：：clpB噬菌體培養(yǎng)的大腸桿菌中抗α-MSH抗體的標(biāo)記更明顯。抗α-MSH抗體通過交叉反應(yīng)與ClpB結(jié)合。在本實(shí)驗(yàn)過程中，與沒有噬菌體或野生型T4噬菌體定植的小鼠相比，有T4：：clpB噬菌體定植的小鼠體重顯著降低（圖5h）。用T4：：clpB噬菌體定植小鼠的食物消耗量減少（圖5I），這與夜間活動(dòng)增加有關(guān)（圖5j）。DIO在小鼠模型中導(dǎo)致炎癥。與野生型T4噬菌體相比，T4：：clpB噬菌體定植的小鼠中的幾種促炎細(xì)胞因子減少，例如IL-1α和IL-1β。其他細(xì)胞因子也有所減少，包括單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、IL-17A和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5k）。
圖5 T4：：clpB對減少食物消耗和體重增加的功效
小結(jié)
綜上所述，本研究表明在正常的噬菌體感染過程中，工程毒性噬菌體T4可以利用與細(xì)菌宿主的共存產(chǎn)生持續(xù)的原位效應(yīng)，協(xié)調(diào)哺乳動(dòng)物腸道中異源蛋白的產(chǎn)生和釋放。通過工程T4噬菌體在晚期T4噬菌體啟動(dòng)子gp22下表達(dá)sfgfp，發(fā)現(xiàn)該報(bào)告蛋白在體內(nèi)和體外均顯著表達(dá)。T4產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑serpin B1a可以降低結(jié)腸炎期間小鼠腸道中的NE活性。最后，研究發(fā)現(xiàn)ClpB蛋白的表達(dá)可以顯著減少DIO小鼠模型中的體重增加?？傊狙芯渴且粋€(gè)概念證明的驗(yàn)證，即工程毒性噬菌體可以用于原位生產(chǎn)異源蛋白。
參考文獻(xiàn)：Baker, Z.R., Zhang, Y., Zhang, H. et al. Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02570-7
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