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【寫在前面】：本期推薦的是由上海中醫(yī)藥大學研究團隊近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示黃芪桂枝五物湯通過AMPK/ TrkA/TRPM7通路緩解糖尿病心血管自主神經(jīng)病變。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Huangqi Guizhi Wuwu Decoction alleviates diabetic cardiovascular autonomic neuropathy via AMPK/TrkA/TRPM7 pathway

民族藥理學相關(guān)性：糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（DCAN）是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，顯著增加了心血管疾病死亡的風險。黃芪桂枝五物湯（HGWD）已被證明對DCAN有效，但其潛在機制尚不明確。

研究目的：觀察HGWD對DCAN的臨床療效，并通過動物模型闡明其潛在機制。

材料與方法：本研究共招募了202名符合納入標準的患者進行臨床試驗，并隨機分為兩組。使用美托洛爾作為陽性對照藥。觀察HGWD對DCAN患者心率變異性的影響。為了進一步闡明其潛在機制，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）測定了HGWD中7種主要成分的含量。利用網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接預測HGWD治療DCAN的潛在機制。采用高脂飲食（HFD）和鏈脲佐菌素（STZ）注射誘導糖尿病大鼠模型。造模成功后，用含有TRPM7重組質(zhì)粒的腺相關(guān)病毒載體（pAAV-TRPM7）對大鼠進行4周的預處理。

結(jié)果：臨床研究表明，HGWD能減少室性早搏次數(shù)，改善心率變異性，糾正DCAN患者心臟自主神經(jīng)的不平衡。體內(nèi)實驗表明，HGWD降低了糖尿病大鼠對心律失常的易感性，改善了糖尿病誘導的心肌纖維化，抑制了心臟自主神經(jīng)重塑，并促進了糖尿病大鼠心臟交感神經(jīng)的修復。從機制上講，HGWD通過上調(diào)AMPK / TrkA通路，從而抑制TRPM7通道，對DCAN產(chǎn)生了改善作用。

結(jié)論：HGWD通過調(diào)節(jié)AMPK / TrkA / TRPM7通路，抑制心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的重塑，降低室性心律失常的易感性，并改善DCAN，為其臨床應用提供了有力支持。

（圖文摘要）

【前言】

糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（DCAN）是糖尿病微血管并發(fā)癥中的一種自主神經(jīng)病變，其特征是調(diào)節(jié)心臟和血管的自主神經(jīng)纖維受損。這會導致交感和副交感神經(jīng)之間的平衡失調(diào)，進而引起心率和血液動力學異常。長期高血糖會引發(fā)心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的神經(jīng)重塑，擾亂心臟電生理和復極離散度，并且是糖尿病相關(guān)致命性心律失常發(fā)生的關(guān)鍵因素。臨床流行病學研究顯示，約60%的糖尿病患者會并發(fā)DCAN，其室性心律失常和心臟性猝死的發(fā)生率是非糖尿病患者的約5倍。這凸顯了糖尿病對患者長期預后的重大威脅。目前，DCAN的確切病理機制尚不明確，臨床管理主要圍繞癥狀控制展開，通常采用β受體阻滯劑、心肌代謝增強劑和神經(jīng)營養(yǎng)藥物，并結(jié)合嚴格的血糖控制。然而，由于心臟自主神經(jīng)之間的復雜協(xié)同和拮抗關(guān)系，臨床上的單一藥物治療往往難以有效解決心臟自主神經(jīng)的重塑問題。因此，迫切需要更有效的治療策略，以最大化臨床獲益并改善預后。

有趣的是，5'-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）已被確定為葡萄糖的高敏感受體，它能夠?qū)⒛芰扛袘獧C制與代謝途徑聯(lián)系起來。多項研究已證實AMPK在調(diào)節(jié)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥（包括心臟問題和糖尿病神經(jīng)病變）方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。胰島素受體底物（IRS）的Ser789位點作為Trk受體信號適配蛋白，可被AMPK磷酸化，從而調(diào)節(jié)相關(guān)信號事件。神經(jīng)生長因子（NGF）在心臟再神經(jīng)支配中起決定性作用，對交感神經(jīng)再生和過度神經(jīng)支配至關(guān)重要。酪氨酸激酶受體A（TrkA）是NGF的高親和力受體。被NGF激活的TrkA通過PI3K信號通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元中TRPM7的表達。

TRPM7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，在心臟中高表達，并在胚胎發(fā)育期間的心肌細胞中高度集中。眾多研究表明，沉默TRPM7不僅抑制空腹胰島素降低和胰腺β細胞抗體水平升高，還能預防高血糖引起的血管內(nèi)皮損傷和神經(jīng)元死亡。此外，TRPM7通道通過調(diào)節(jié)Ca2 +和Mg2 +的平衡發(fā)揮抗心律失常和抗心肌纖維化作用。抑制TRPM7是DCAN的潛在治療策略，但糖尿病心臟神經(jīng)中TRPM7的變化和作用尚不清楚。

然而，由于DCAN病理過程的復雜性，使用單一機制藥物難以實現(xiàn)全面和系統(tǒng)的心臟保護。中藥方劑作為輔助醫(yī)學的重要組成部分和心血管藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源，因其多種活性和有效成分的協(xié)同作用而越來越受到關(guān)注。

黃芪桂枝五物湯（HGWD）是公元3世紀初《金匱要略》中的經(jīng)典傳統(tǒng)中藥方劑，用于治療與DCAN臨床表現(xiàn)相同的血瘀癥，并在糖尿病神經(jīng)病變的治療中顯示出明確且精準的療效。從中醫(yī)角度看，DCAN的發(fā)病機制可以從營衛(wèi)不和的角度來理解。HGWD被認為具有調(diào)和營衛(wèi)的功能。HGWD由黃芪、桂枝、白芍、生姜和大棗按1:1:1:2:1.1的比例組成。研究表明，HGWD中的活性成分芍藥苷可激活AMPK通道，而黃芪皂苷IV可抑制TRPM7通道。然而，HGWD在改善DCAN方面的藥理作用和機制尚不明確。鑒于AMPK與糖尿病相關(guān)神經(jīng)病變有關(guān)，我們假設(shè)激活AMPK可能磷酸化TrkA，從而抑制TRPM7信號傳導，延緩糖尿病心臟自主神經(jīng)重塑。

本研究采用系統(tǒng)方法，通過隨機臨床試驗、超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）分析、生物信息學、基因過表達模型和多種藥理實驗，全面探討HGWD對DCAN的治療效果。我們對HGWD的研究為推進DCAN新藥研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，闡明了HGWD治療DCAN的機制，并為未來HGWD研究提供了創(chuàng)新方向。

【結(jié)果】

臨床研究：研究對象特征（臨床數(shù)據(jù)證明HGWD與美托洛爾療效相當）

本研究共招募202名患者參與臨床試驗，按1:1比例隨機分為對照組（使用美托洛爾和標準治療）和HGWD組（使用HGWD和標準治療）。觀察期間，對照組3人、HGWD組2人因失訪被排除，HGWD組另有3人拒絕治療被排除。最終194名患者完成試驗，其中HGWD組95人，對照組99人?；颊呋€特征見表2，兩組基線數(shù)據(jù)無顯著差異。

臨床研究：HGWD治療改善DCAN患者的心率變異性

SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50水平反映心臟自主功能。SDNN和SDANN水平與交感神經(jīng)活動呈負相關(guān)，RMSSD和pNN50水平與副交感神經(jīng)活動呈正相關(guān)。治療后，兩組HbA1c水平和室性早搏次數(shù)顯著下降（P < 0.05，P < 0.01），SDNN、SDANN和pNN50水平不同程度升高。但對照組治療后RMSSD水平與治療前相比無統(tǒng)計學差異（表3和表4）。此外，HGWD組治療后SDNN、RMSSD和pNN50的上調(diào)幅度大于對照組（P < 0.05）（表5）。

1、HGWD抑制STZ誘導的心律失常和心肌重塑易感性

采用PES和心電圖評估HGWD對心律失常易感性的影響。結(jié)果顯示，模型組PES后易發(fā)生多種心律失常，包括室性早搏和室性心動過速，室性心律失常發(fā)生率顯著高于對照組（P < 0.05），表明模型組心律失常易感性增加。相比之下，HGWD以劑量依賴性方式降低PES后心律失常和室性心律失常的發(fā)生率，提示HGWD可有效降低糖尿病心律失常的發(fā)生率（圖1A和B）。隨后，采用組織病理學方法評估HGWD對糖尿病大鼠的影響。H&E染色結(jié)果顯示，HGWD可改善心肌纖維化。對照組心肌細胞結(jié)構(gòu)清晰、排列有序、大小正常、形態(tài)規(guī)則，無炎癥細胞浸潤；模型組心肌細胞大小不一、排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊，并有少量炎癥細胞浸潤。

HGWD治療后，心肌細胞排列更有序，體積減小，形態(tài)清晰（圖1C）。STZ干預使心肌纖維化標志物表達異常增加。因此，采用Masson染色定量評估心肌纖維化程度。結(jié)果顯示，模型組心肌組織中膠原纖維面積顯著增加，增殖廣泛，盤繞成網(wǎng)并不規(guī)則地包圍心肌纖維組織。而HGWD組心肌纖維排列整齊，無斷裂，HGWD顯著以劑量依賴性方式減少心肌組織中膠原纖維面積（圖1D和E）。

HGWD抑制糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)重塑并促進心臟交感神經(jīng)修復

通過免疫組化、RT-qPCR和Western Blot評估心臟自主神經(jīng)再生標志物（TH、ChAT和GAP-43）水平，確定HGWD對糖尿病自主神經(jīng)病變的影響。既往研究表明，TH和ChAT陽性表達分別代表心臟交感和副交感神經(jīng)分布，GAP-43可用于評估心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)生長活性。免疫組化結(jié)果顯示，模型組心肌組織中TH、ChAT和GAP-43陽性神經(jīng)纖維分布顯著增加，以及上頸交感神經(jīng)節(jié)中GAP-43陽性神經(jīng)纖維分布增加。HGWD組陽性神經(jīng)纖維分布面積顯著減少，高劑量組減少更明顯（圖1F-I）。

2、 HGWD 中主要成分的定量分析

3、網(wǎng)絡藥理學預測 HGWD 治療 DCAN 的機制

基于 TCMSP 數(shù)據(jù)庫和 UPLC-MS 分析，確定 HGWD 的 75 種活性成分。獲得與 HGWD 成分相關(guān)的 1728 個靶點以及 DCAN 的 1906 個潛在靶點。隨后，確定其中 276 個靶點為 HGWD 治療 DCAN 的潛在治療靶點（圖 3A）。通過 Cytoscape 3.6.0 分析發(fā)現(xiàn)，有 60 個核心靶點的度值≥10（圖 3B）。對這 60 個核心治療靶點進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。根據(jù) GO 富集分析，HGWD 對 DCAN 的分子功能涉及蛋白激酶結(jié)合和蛋白激酶活性。生物過程與細胞對細胞因子刺激的反應和對激素的反應有關(guān)。細胞組分與膜筏和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合體等有關(guān)（圖 3C 和 D）。此外，KEGG 分析表明，HGWD 治療 DCAN 可能與 AMPK 信號通路有關(guān)（圖 3E）。

4、基于生物信息學預測 HGWD 中活性成分與 AMPK 靶點的相互作用

采用分子對接和表面等離子體共振（SPR）技術(shù)，確定 HGWD 中的 7 種活性成分與 AMPK 的特異性結(jié)合模式和親和力。在分子對接過程中，調(diào)整它們的構(gòu)象以結(jié)合到不同的蛋白質(zhì)空腔中，每組對接運行重復 3 次。我們計算了平均值和標準差，結(jié)果顯示大多數(shù)關(guān)鍵成分對靶點具有較強的結(jié)合特性（表 6），并選擇對接結(jié)果的最佳結(jié)合模式進行三維可視化（圖 4）。其中，芍藥苷通過與 AMPK 的 PHE-27、ASN-162、LYS-60、LYS-141 和 THR-26 形成氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為 -7.27±0.35 千卡 / 摩爾，抑制常數(shù)（Ki）為 4.65 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 35.73 微摩爾。木蝴蝶素通過與 AMPK 的 GLY-28、GLY-27、ASP-157 和 GLY-25 形成氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為 -7.07±0.12 千卡 / 摩爾，Ki 為 6.55 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 0.28 微摩爾。

黃芪皂苷 IV 通過與 AMPK 的 PHE-27 和 GLY-28 形成氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為 -7.73±0.15 千卡 / 摩爾，Ki 為 2.15 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 7.31 微摩爾。桂皮醛通過形成 3 個氫鍵與 AMPK 結(jié)合，結(jié)合能為 -5.13±0.12 千卡 / 摩爾，Ki 為 1.72 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 0.01 微摩爾。其中，芍藥苷、木蝴蝶素和黃芪皂苷 IV 可以結(jié)合到 AMPK，并且具有快速結(jié)合和解離的特性。因此，很可能黃芪皂苷 IV 或芍藥苷和 AMPK 形成了穩(wěn)定的復合物，這可以促進 PHE-27 與磷酸結(jié)合并發(fā)生磷酸化，從而激活 AMPK。同時，黃芪皂苷 IV 或木蝴蝶素也可能與 AMPK 形成穩(wěn)定的復合物，這可以促進 GLY-28 與磷酸結(jié)合并發(fā)生磷酸化。上述結(jié)果預測 AMPK 可能是 HGWD 活性成分對 DCAN 保護作用的潛在靶點。

5、HGWD 通過調(diào)節(jié) AMPK/TrkA 通路抑制糖尿病心臟自主神經(jīng)病變

進一步研究表明，在糖尿病模型中，AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平降低，而 HGWD 能夠逆轉(zhuǎn)這種效應（圖 5A 和 B）。

基于上述分子對接和 SPR 結(jié)果，為了確定 HGWD 是否通過上調(diào) AMPK/TrkA 信號來改善 DCAN，我們使用 AMPK 抑制劑來消除 HGWD 在糖尿病模型中促進 AMPK 磷酸化的作用，并使用 AMPK 激動劑來模擬 HGWD 促進 AMPK 磷酸化的效果。

結(jié)果表明，AMPK 激活后，糖尿病心律失常易感性降低，PES 后誘導室性心律失常的可能性降低。相反，抑制 AMPK 表達后，心律失常易感性增加。與 AMPK 抑制劑組相比，HGWD + AMPK 抑制劑組的心律失常易感性降低，這表明HGWD 通過激活 AMPK 抑制糖尿病心律失常易感性（圖 5C 和 D）。

免疫組化結(jié)果顯示，AMPK 激活減少了心肌組織中 TH 和 ChAT 陽性神經(jīng)纖維的分布面積，而 AMPK 抑制則使相關(guān)陽性神經(jīng)纖維的分布面積比模型組增加。此外，與 AMPK 抑制劑組相比，HGWD + AMPK 抑制劑組中所有陽性神經(jīng)纖維的分布面積均有所減少（圖 5E 和 F）。Western Blot 顯示，與模型組相比，HGWD 組和 AMPK 激動劑組中 AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平以及 NGF 表達水平升高，而 TH 和 ChAT 表達水平降低。相反，AMPK 抑制劑干預則產(chǎn)生相反的效果。與 AMPK 抑制劑組相比，HGWD 治療后 AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平以及 NGF 表達水平顯著升高，而 TH 和 ChAT 表達水平顯著降低（圖 5G 和 H）。這證實了 HGWD 通過激活 AMPK/TrkA 通路對 DCAN 發(fā)揮治療作用的假設(shè)是可行的（進一步論證）。

6、TRPM7 是糖尿病心血管自主神經(jīng)病變的關(guān)鍵介質(zhì)

研究表明，TrkA 受體與 TRPM7 在海馬神經(jīng)元上共定位，TrkA 信號通路參與調(diào)節(jié)缺血再灌注和氧糖剝奪期間海馬神經(jīng)元中 TRPM7 的表達。然而，TrkA 與 TRPM7 在 DCAN 中的關(guān)系尚未得到證實。首先，我們對 TrkA 和 TRPM7 進行了剛性蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)對接，以預測它們之間的關(guān)系。如圖 6A 和表 7 所示，TrkA 和 TRPM7 通過酪氨酸 104 - 谷氨酸 164 和組氨酸 108 - 谷氨酸 164 等氨基酸殘基位點形成氫鍵，表明兩者之間形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對接模型。

為了驗證兩者之間的關(guān)系，我們使用了 TrkA 激動劑（鹽酸阿米替林）和 TrkA 抑制劑（larotractinib）來觀察它們對 TRPM7 的影響。Western blot 和免疫熒光結(jié)果顯示，模型組上頸交感神經(jīng)節(jié)中 TRPM7 水平顯著升高，HGWD 處理后 TRPM7 表達水平降低。而在 TrkA 抑制劑組中 TRPM7 水平升高，在 TrkA 激動劑組中 TRPM7 水平降低。與 TrkA 抑制劑組相比，HGWD 處理顯著降低了 TRPM7 的表達水平（圖 6B–E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HGWD 可以通過上調(diào) TrkA 磷酸化水平來抑制 TRPM7 的表達，從而改善 DCAN（兩兩驗證）。

7、 HGWD 通過調(diào)節(jié) AMPK/TrkA/TRPM7 信號通路降低心律失常易感性和抑制心肌纖維化

如圖 6BE 所示，與模型組相比，HGWD 干預后 TRPM7 水平顯著降低。為了進一步證實 HGWD 在 DCAN 中對 TRPM7 的潛在調(diào)節(jié)作用，我們將 AAV-TRPM7 過表達病毒注入糖尿病大鼠的尾靜脈。15 天后，通過 RT-qPCR 和 Western blot 驗證了 TRPM7 的過表達效率（圖 7AB）。隨后，我們對 HGWD 處理組進行了觀察，以了解其對表型和蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，模型組心律失常易感性增加，PES 后更易誘發(fā)室性早搏和室性心動過速。相比之下，TRPM7 抑制劑組心律失常的誘發(fā)率顯著降低，而 TRPM7-OE 組室性心律失常的誘發(fā)率顯著升高，這表明抑制 TRPM7 表達可以降低心律失常的易感性。此外，與 TRPM7-OE 組相比，HGWD + TRPM7-OE 組室性心律失常的發(fā)生率顯著降低，這表明 HGWD 逆轉(zhuǎn)了 TRPM7 激活引起的心臟易感性增加（圖 7CD）。

在組織病理學水平上，HE 染色結(jié)果顯示，TRPM7 抑制劑組細胞排列更有序，形態(tài)更清晰，而 TRPM7-OE 組心肌細胞排列紊亂，伴有大量炎癥細胞浸潤和少量出血點。相反，HGWD + TRPM7-OE 組細胞排列有序，形態(tài)規(guī)則，體積較小，組織中炎癥細胞浸潤較少，無出血點（圖 7E）。Masson 染色結(jié)果顯示，與模型組相比，TRPM7 抑制劑組心肌組織中膠原纖維面積顯著減少，而 TRPM7-OE 組則顯著增加。經(jīng) HGWD 處理后，心肌組織的膠原纖維面積較 TRPM7-OE 組減少（圖 7F 和 G）。上述病理結(jié)果表明，TRPM7 過表達加劇了糖尿病心肌纖維化，而 HGWD 通過沉默 TRPM7 改善了心肌纖維化。

8、 HGWD 通過抑制 TRPM7 減輕糖尿病心臟自主神經(jīng)重塑并促進心臟交感神經(jīng)修復

在糖尿病大鼠中激活 TRPM7 表達后，我們進一步使用免疫組化和免疫熒光檢測心肌和交感神經(jīng)節(jié)組織中 TH、ChAT 和 GAP-43 的分布。這旨在探討 HGWD 在改善糖尿病自主神經(jīng)重塑效果中的潛在機制。結(jié)果顯示，糖尿病心肌組織中 TH、GAP-43 和 ChAT 陽性神經(jīng)纖維的分布增加。與模型組相比，TRPM7 抑制劑組中棕色染色的 TH、GAP-43 和 ChAT 陽性神經(jīng)纖維的分布面積顯著減少，而 TRPM7-OE 組則顯著增加。同時，與 TRPM7-OE 組相比，HGWD 處理減少了 TH、GAP-43 和 ChAT 陽性神經(jīng)纖維的分布面積，表明 HGWD 通過抑制 TRPM7 表達降低了心肌組織中 TH、ChAT 和 GAP-43 的表達水平（圖 8A 和 C）。

此外，免疫組化顯示，交感神經(jīng)節(jié)中 GAP-43 和 TRPM7 的分布趨勢與心肌組織中一致。與模型組相比，抑制 TRPM7 減少了交感神經(jīng)中 GAP-43 陽性神經(jīng)纖維的分布，而激活 TRPM7 則增加了陽性神經(jīng)纖維的分布。經(jīng) HGWD 處理后，陽性神經(jīng)纖維的分布面積顯著減少，表明 HGWD 通過沉默 TRPM7 促進交感神經(jīng)修復（圖 8B 和 D）。

9、在免疫熒光實驗中，TH 和 ChAT 呈綠色，TRPM7 呈紅色。這些結(jié)果表明，DCAN 與 TRPM7 的上調(diào)有關(guān)。

與模型組相比，經(jīng) HGWD 和 TRPM7 抑制劑處理后，TH-TRPM7 和 ChAT-TRPM7 雙標熒光強度降低，而 TRPM7-OE 組則顯著增強，表明 TRPM7 激活傾向于誘導糖尿病心臟自主神經(jīng)增生。此外，與 TRPM7-OE 組相比，HGWD + TRPM7-OE 組中 TH-TRPM7 和 ChAT-TRPM7 雙標的熒光強度降低（圖 9）。

10、為了探討 HGWD 是否影響 TH 和 ChAT 的 mRNA 水平，我們通過 RT-qPCR 檢測了各組的 mRNA 水平變化。

結(jié)果顯示，模型組心肌組織中 TH 和 ChAT 的 mRNA 水平升高，HGWD 降低了兩者的 mRNA 水平，且高劑量時下調(diào)效果更明顯。此外，與模型組相比，TRPM7 抑制劑組的 TH 和 ChAT mRNA 水平顯著降低，而 TRPM7-OE 組則顯著升高。此外，HGWD + TRPM7-OE 組的 TH 和 ChAT mRNA 水平顯著低于 TRPM7-OE 組（圖 10A）。

此外，NGF 是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育并維持其活性的蛋白質(zhì)，長期以來被認為是交感神經(jīng)元生存必需的神經(jīng)營養(yǎng)因子。目前的研究表明，NGF 的表達水平可能與局部交感神經(jīng)支配密度密切相關(guān)。

我們進一步使用 Western Blot 分別檢測了心肌組織和交感神經(jīng)節(jié)中 TH、ChAT、GAP-43 和 NGF 的分布。HGWD 以劑量依賴性方式降低了 TH、GAP-43 和 ChAT 的表達水平，同時增加了 NGF 的表達水平。TRPM7 抑制劑組的 TH、GAP-43 和 ChAT 表達水平較低，NGF 表達水平較高，而 TRPM7-OE 組則相反。經(jīng) HGWD 處理后，HGWD + TRPM7-OE 組的 TH、GAP-43 和 ChAT 表達水平顯著降低，而 NGF 表達水平升高（圖 10B–E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HGWD 通過抑制 TRPM7 對糖尿病自主神經(jīng)重塑產(chǎn)生抑制作用，并促進心臟交感神經(jīng)修復。

近期研究表明，糖尿病心臟自主神經(jīng)重塑降低了室性心律失常的閾值，可能是惡性心律失常事件發(fā)生率升高的重要機制。然而，由于心臟交感和副交感神經(jīng)之間的復雜關(guān)系——它們既協(xié)同又拮抗還相互轉(zhuǎn)化——目前針對單一神經(jīng)的治療干預無法有效解決心臟自主神經(jīng)重塑的問題。中醫(yī)的“營衛(wèi)學說”涵蓋了機體內(nèi)部陰陽的整體和動態(tài)平衡，強調(diào)通過機體自身的調(diào)節(jié)和修復機制恢復穩(wěn)態(tài)。因此，本研究創(chuàng)新性地運用這一理論來理解DCAN的病理生理進展?；谶@一理論框架制定的HGWD在臨床實踐中廣泛用于治療糖尿病神經(jīng)病變，并顯示出獨特的療效。

我們首先通過隨機臨床試驗評估了HGWD治療DCAN的臨床療效。鑒于心率變異性（HRV）的無創(chuàng)性和客觀性，歐美專家組在20世紀90年代提出將HRV作為評估自主神經(jīng)活動的最佳定量指標。HRV捕捉RR間期之間竇性節(jié)律的細微變化，是反映心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡的敏感指標。在糖尿病神經(jīng)病變的早期階段就會出現(xiàn)HRV的變化，這使得能夠監(jiān)測早期糖尿病患者的自主神經(jīng)功能變化，以便早期發(fā)現(xiàn)。在本研究中，我們采用HRV時域分析來研究DCAN患者。HRV參數(shù)包括SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50。

SDNN表示患者平均正常RR間期的標準差，而SDANN表示每5分鐘平均正常RR間期的標準差。這兩個參數(shù)均用于評估交感神經(jīng)系統(tǒng)的活動，其水平降低通常與交感神經(jīng)緊張增加相關(guān)。RMSSD反映相鄰RR間期差值的均方根，而pNN50表示總相鄰RR間期差值>50ms的百分比，兩者均與副交感神經(jīng)活動成正比。對入組患者進行HRV分析發(fā)現(xiàn)，SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50指標均低于正常值，這表明長期高血糖損害了心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的功能，表現(xiàn)為交感神經(jīng)活動增加和副交感神經(jīng)活動受損。經(jīng)過HGWD治療后，與Betaloc組相比，HRV參數(shù)水平在不同程度上有所提高，這表明HGWD抑制了交感神經(jīng)活動，改善了副交感神經(jīng)活動，并可能在保護心臟迷走神經(jīng)的同時恢復自主神經(jīng)系統(tǒng)的平衡。

血糖控制不佳是DCAN的一個獨立危險因素。在血糖調(diào)節(jié)初次失衡時就發(fā)現(xiàn)了心臟自主調(diào)節(jié)受損。長期高血糖導致炎癥介質(zhì)釋放增加、氧化應激和晚期糖基化終產(chǎn)物形成，從而引發(fā)電解質(zhì)和代謝紊亂，這是心臟自主神經(jīng)調(diào)節(jié)異常的基礎(chǔ)。DCCT（糖尿病控制與并發(fā)癥試驗）研究表明，強化血糖控制使DCAN的患病率降低了50%。經(jīng)過HGWD治療后，DCAN患者的HbA1c水平顯著下降。HGWD通過其降糖作用同時緩解了DCAN。在這方面，建議加強對T2DM患者血糖水平和HbA1c水平的臨床監(jiān)測，這有助于減少DCAN的發(fā)生。

此外，糖尿病患者的心臟交感神經(jīng)會發(fā)生過度增生，即所謂的神經(jīng)重塑。長期高血糖可導致心臟自主神經(jīng)（包括交感神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)）的重新分布。交感和副交感神經(jīng)在空間分布和功能上的不平衡導致心肌細胞對兒茶酚胺和乙酰膽堿的敏感性發(fā)生改變，從而引起心肌細胞的電生理紊亂。TH、ChAT和GAP-43是心臟自主神經(jīng)重新分布的相關(guān)標志物。其中，TH反映心臟中交感神經(jīng)的分布，ChAT是對迷走神經(jīng)分布和重新分布的標志物，而GAP-43是用于標記新生心臟中自主神經(jīng)的重要物質(zhì)之一。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，TH、ChAT和GAP-43的水平顯著升高。HGWD干預減緩了這一進程，減少了PES后誘發(fā)室性早搏和室性心動過速等心律失常的可能性。這表明HGWD可以降低糖尿病心律失常的易感性，抑制糖尿病自主神經(jīng)重塑，并促進心臟交感神經(jīng)的修復。

為了更好地理解HGWD治療DCAN的藥理機制，我們進行了UPLC-MS、網(wǎng)絡藥理學、分子對接和SPR實驗。結(jié)果表明，HGWD的活性成分可能通過激活AMPK通路對DCAN發(fā)揮治療作用。AMPK作為一種對葡萄糖高度敏感的受體，是糖尿病和其他代謝性疾病研究的焦點。STZ誘導的糖尿病會導致嚴重高血糖，隨后損害神經(jīng)生物能量學并降低AMPK活性。作為一種AMPK激活劑，二甲雙胍已被證明可以緩解糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)的痛覺過敏和觸覺過敏。

在我們的研究中，HGWD治療在糖尿病大鼠中對AMPK通路產(chǎn)生了與二甲雙胍類似的影響。HGWD治療顯著激活了AMPK通路。此外，HGWD對AMPK通路的激活影響了糖尿病大鼠中TrkA的表達。我們觀察到在高糖條件下TrkA活性受到抑制，而AMPK信號的抑制導致TrkA磷酸化水平顯著下降，同時神經(jīng)標志物的表達水平顯著上升。然而，HGWD干預上調(diào)了AMPK/TrkA的表達水平。

研究表明，在神經(jīng)元中，AMPK在Ser789處磷酸化TrkA信號適配蛋白IRS。TrkA作為NGF的特異性高親和力受體，介導NGF的大多數(shù)生物功能。值得注意的是，TrkA促進神經(jīng)再生和修復，其與上游NGF的結(jié)合抑制了炎癥因子的釋放，從而減少炎癥引起的神經(jīng)損傷。NGF在心臟再神經(jīng)支配中起著關(guān)鍵作用，作為參與交感神經(jīng)再生和過度神經(jīng)支配的化學趨向因子。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HGWD增加了NGF的表達水平，并在糖尿病模型中促進了心臟交感神經(jīng)的再生。此外，Ieda等指出，糖尿病會導致心肌細胞中NGF表達下降，從而引發(fā)DCAN。

此外，被NGF激活的TrkA通過PI3K信號通路在海馬神經(jīng)元中抑制TRPM7的表達。研究表明，電針可以通過TrkA/PI3K途徑調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注后TRPM7的表達。剛性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接結(jié)果表明，TrkA和TRPM7形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對接模型。我們發(fā)現(xiàn)，TrkA激活后TRPM7水平下降，這表明TrkA直接影響TRPM7的表達，無需通過其他途徑介導。利用pAAV-TRPM7干擾糖尿病大鼠中TRPM7的表達，我們的研究表明，TRPM7的激活增加了心律失常的易感性，加劇了心肌纖維化，并提高了心臟自主神經(jīng)重新分布標志物的表達水平。這表明TRPM7可能是抑制自主神經(jīng)重塑的潛在靶點。

研究表明，TRPM7在糖尿病的病理生理過程中發(fā)揮作用，在高糖條件下在免疫細胞和血管內(nèi)皮細胞中大量表達。TRPM7是胰腺內(nèi)分泌發(fā)育和高脂飲食誘導的β細胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。抑制TRPM7表達已被證明可以提高葡萄糖刺激的胰島素分泌，以緩解Ⅰ型糖尿病。同時，通過基因沉默抑制成年大鼠大腦中的TRPM7通道，結(jié)果導致神經(jīng)元死亡顯著減少，從而表明TRPM7通道可能對神經(jīng)元具有保護作用。綜上所述，HGWD通過激活AMPK、進一步磷酸化TrkA以及促進TrkA與NGF的結(jié)合，在預防和控制DCAN方面發(fā)揮了重要作用，從而抑制了TRPM7通道的表達。

最后，由于臨床研究樣本量較小、觀察期較短，有必要進一步增加樣本量和觀察指標，以獲得更客觀的研究結(jié)果。

【結(jié)論】

綜上所述，HGWD通過調(diào)節(jié)AMPK/TrkA/TRPM7通路，抑制了心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的重塑，降低了室性心律失常的易感性，并改善了DCAN。進一步闡明了TRPM7與DCAN之間的新關(guān)聯(lián)，提示TRPM7可能是解決自主神經(jīng)重塑問題的潛在靶點。此外，本研究為在慢性病干預中應用傳統(tǒng)中藥方劑HGWD奠定了基礎(chǔ)，突顯了其高度的臨床適用性。

關(guān)鍵實驗步驟與邏輯鏈

1、臨床療效驗證

對象：194例DCAN患者（HGWD組 vs 美托洛爾組）

指標：HRV參數(shù)（SDNN、RMSSD等）、HbA1c、室性早搏次數(shù)

結(jié)論：HGWD顯著改善自主神經(jīng)失衡，效果與美托洛爾相當。

2、活性成分鑒定

方法：UPLC-MS定量分析HGWD中7種成分（如芍藥苷46.7851 μg/mL）

3、網(wǎng)絡藥理學預測

數(shù)據(jù)庫挖掘：HGWD成分→276個潛在靶點，KEGG富集顯示AMPK通路相關(guān)。

分子對接：芍藥苷、黃芪皂苷IV等與AMPK結(jié)合能≤-5 kcal/mol，提示強結(jié)合。

4、AMPK/TrkA通路驗證

動物干預：糖尿病大鼠分組（HGWD組、AMPK激動劑組、AMPK抑制劑組）