小麥條銹病發(fā)生范圍廣、暴發(fā)性強(qiáng)、流行成災(zāi)頻率高，常造成10-30%的小麥產(chǎn)量損失，甚至絕產(chǎn)，被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入I類農(nóng)作物病害。其病原菌作為活體營(yíng)養(yǎng)專性寄生真菌，通過侵染結(jié)構(gòu)吸器向小麥細(xì)胞分泌致病因子以抑制植物免疫，并向活體組織汲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其侵染部位通常會(huì)出現(xiàn)葉綠素滯留，稱為“綠島”。綠島的形成通常被認(rèn)為有利于病原菌通過延長(zhǎng)寄主細(xì)胞活性以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收。然而，活體營(yíng)養(yǎng)型專性寄生真菌如何誘導(dǎo)寄主綠島形成以促進(jìn)病害發(fā)生的分子機(jī)制仍然知之甚少。
近日，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魏育明/許強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合西北農(nóng)林科技大學(xué)王曉杰教授在Nature Communications在線發(fā)表了題為“A fungal pathogen suppresses host leaf senescence to increase infection”的研究論文，揭示了銹菌致病因子Pst_TTP1抑制TaTrx-TaSGR1模塊介導(dǎo)的葉片衰老及ROS積累，促進(jìn)小麥感條銹病。
研究發(fā)現(xiàn)，敲除TaSGR1或TaTrx減弱小麥對(duì)條銹菌的抗性。蛋白互作手段鑒定小麥滯綠蛋白TaSGR1與硫氧還蛋白TaTrx在葉綠體中相互作用，硫氧還蛋白TaTrx行使氧化還原功能催化TaSGR1由寡聚體向單體的轉(zhuǎn)化，加速小麥組織衰老、H2O2積累和細(xì)胞死亡，增強(qiáng)了寄主抗性。而銹菌致病因子Pst_TTP1分泌到寄主細(xì)胞質(zhì)中與硫氧還蛋白TaTrx結(jié)合，阻止TaTrx向葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而抑制了葉綠體中TaTrx-TaSGR1級(jí)聯(lián)反應(yīng)。綜上，該研究不僅闡明了植物利用葉綠體誘導(dǎo)活性氧促進(jìn)葉片衰老以應(yīng)對(duì)專性寄生真菌營(yíng)養(yǎng)寄生的抗病機(jī)制。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了病原菌能夠利用這一機(jī)制促進(jìn)作物感病。本研究為合理利用精準(zhǔn)編輯開發(fā)葉綠體功能、打破病原菌的操縱，有效減輕作物病害發(fā)生、發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。
以下是該研究的主要研究結(jié)果：
1. TaSGR1正調(diào)控小麥對(duì)條銹菌的抗性
前期研究篩選鑒定TaSGR1參與小麥抗條銹過程中，通過轉(zhuǎn)基因TaSGR1OE株系接種強(qiáng)致病力的條銹菌株CYR31和CYR34后，與對(duì)照Fielder相比，條銹菌生物量顯著降低了50%-60%，且產(chǎn)生顯著的過敏性壞死反應(yīng)。而且，過表達(dá)植株TaSGR1OE葉片中的葉綠素含量顯著降低。組織細(xì)胞學(xué)觀察，轉(zhuǎn)基因TaSGR1OE株系接菌后產(chǎn)生大量ROS。而接種弱致病力條銹菌CYR23后，植株對(duì)條銹菌的抗病性減弱，tasgr1-ABD、tasgr1-AB和tasgr1-B植株均產(chǎn)生明顯的夏孢子?；谶@些結(jié)果，表明TaSGR1在抗條銹病中起正調(diào)控作用。
圖1 TaSGR1正調(diào)控小麥對(duì)條銹菌的抗性
2. TaSGR1與葉綠體硫氧還蛋白TaTrx互作
運(yùn)用酵母雙雜交篩選獲得TaSGR1互作蛋白TaTrx。酵母一對(duì)一驗(yàn)證二者是發(fā)生互作。TaTrx與TaSGR1的STAYGREEN結(jié)構(gòu)域互作，而與TaSGR1的富含半胱氨酸區(qū)域不互作。BIFC檢測(cè)到TaSGR1-TaTrx在葉綠體中有較強(qiáng)的互作熒光信號(hào)，免疫共沉淀表明TaSGR1蛋白與TaTrx有很強(qiáng)的相互作用。綜上結(jié)果表明，TaSGR1與葉綠體中的TaTrx相互作用。在Fielder植株中基因編輯TaTrx，tatrx-ABD植株接種條銹菌CYR23后，出現(xiàn)零星的夏孢子，真菌生物量增加了60%，表明TaTrx的缺失影響了小麥對(duì)條銹菌的抗性。
圖2 TaSGR1與葉綠體硫氧還蛋白TaTrx互作
3. TaTrx促進(jìn)TaSGR1蛋白由寡聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w
對(duì)TaSGR1結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)到一個(gè)保守的富含半胱氨酸的基序可能會(huì)形成二硫鍵（C241、C245、C247、C248和C253）。將5個(gè)半胱氨酸突變后（TaSGR15A），寡聚TaSGR1蛋白無法形成。在體外實(shí)驗(yàn)中，原核表達(dá)蛋白TaSGR1-His出現(xiàn)了寡聚化；用β-巰基乙醇處理后，僅檢測(cè)到單體TaSGR1。在轉(zhuǎn)基因TaSGR1OE株系中過表達(dá)TaTrx。TaTrx促進(jìn)寡聚TaSGR1豐度的降低，但單體TaSGR1的豐度提高了，而酶活缺失突變體（TaTrxM）對(duì)此則沒有影響。在轉(zhuǎn)基因TaSGR1OE株系接菌后，TaSGR1單體豐度降低，表明TaSGR1可能被TaTrx從寡聚體還原為單體，而TaSGR1單體形式可能參與植物抗病反應(yīng)。
圖3 TaTrx蛋白催化TaSGR1寡聚體向單體的轉(zhuǎn)變
4. Pst_TTP1阻止TaTrx進(jìn)入葉綠體，抑制了TaSGR1的功能
對(duì)瞬時(shí)表達(dá)Pst_TTP1-HA-GFP或GFP的Fielder植株葉片進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)葉綠體分離實(shí)驗(yàn)。在表達(dá)GFP葉片的細(xì)胞質(zhì)中，使用anti-Trx抗體檢測(cè)到TaTrx主要積累在葉綠體中，而在表達(dá)Pst_TTP1-HA-GFP的葉片中檢測(cè)到TaTrx蛋白在細(xì)胞質(zhì)大量積累，這些結(jié)果表明Pst_TTP1阻止TaTrx進(jìn)入葉綠體。以tatrx編輯材料為背景，過表達(dá)TaTrx或TaTrxM進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TaTrx能夠恢復(fù)材料的抗性，而TaTrxM不能。在TaSGR1OE材料中表達(dá)Pst_TTP1和GUS、TaTrx和GUS以及TaTrx和Pst_TTP1，進(jìn)行非變性凝膠電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)TaTrx促進(jìn)TaSGR1寡聚體的解聚。而瞬轉(zhuǎn)Pst_TTP1抑制了TaSGR1的解聚。此外，還評(píng)估了Pst_TTP1對(duì)TaSGR1誘導(dǎo)的葉綠體ROS積累的影響。TaTrx和TaSGR1的共表達(dá)誘導(dǎo)葉綠體中ROS的大量積累。Pst_TTP1能夠抑制TaSGR1介導(dǎo)的葉綠體ROS的產(chǎn)生。因此，Pst_TTP1可能通過干擾TaTrx在葉綠體中的定位，從而削弱TaSGR1的功能并抑制植物免疫。
圖4 銹菌致病因子Pst_TTP1阻止TaTrx進(jìn)葉綠體，抑制了TaSGR1的氧化還原
5. Pst_TTP1-TaTrx-TaSGR1作用機(jī)制
在受條銹感染的植物細(xì)胞中，銹菌致病因子Pst_TTP1被分泌并轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞質(zhì)中，與葉綠體TaTrx硫氧還蛋白相互作用，阻止其進(jìn)入葉綠體（圖5）。進(jìn)而阻止TaTrx催化TaSGR1寡聚體向單體的轉(zhuǎn)化，減弱了TaSGR1的葉綠素酶活性，導(dǎo)致ROS積累減少，抑制了植物的防御反應(yīng)。在鄰近未感染的細(xì)胞中（無Pst_TTP1），TaTrx正常調(diào)節(jié)葉綠體內(nèi)TaSGR1氧化還原狀態(tài)，促進(jìn)葉綠體ROS的積累（圖5）。
四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士研究生李悅和曲翔汝為論文共同第一作者。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)許強(qiáng)教授、魏育明教授和西北農(nóng)林科技大學(xué)王曉杰教授為該論文的共同通訊作者。該研究獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金、四川省自然科學(xué)基金、西南作物基因資源發(fā)掘與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等的資助。
來源：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
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