游離脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA）作為生物燃料、高值化學(xué)品及藥物合成的重要原料，其微生物高效合成是合成生物學(xué)領(lǐng)域的核心挑戰(zhàn)之一。傳統(tǒng)代謝工程策略多聚焦于直接調(diào)控脂肪酸合成通路，但 FFA 的胞內(nèi)積累易引發(fā)質(zhì)子失衡、膜損傷及氧化應(yīng)激等問題，嚴(yán)重限制產(chǎn)量提升。
近日，天津大學(xué)曹英秀團(tuán)隊(duì)近期在 Nature Communications 發(fā)表題為“Genome-scale CRISPRi screen identifies pcnB repression conferring improved physiology for overproduction of free fatty acids in Escherichia coli”的論文，通過全基因組 CRISPRi 篩選技術(shù)，系統(tǒng)解析大腸桿菌生理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化關(guān)鍵基因，最終構(gòu)建出 FFA 產(chǎn)量達(dá) 35.1 g/L 的工程菌株，刷新微生物合成 FFA 的紀(jì)錄。這一成果不僅為脂肪酸生物制造提供了全新范式，更揭示了生理工程在細(xì)胞工廠構(gòu)建中的全局性價(jià)值。
研究團(tuán)隊(duì)通過結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 和下一代測(cè)序 (NGS) 的基因組規(guī)模 CRISPRi 篩選。在首輪篩選中，編碼多聚腺苷酸化酶 I（PAPI）的 pcnB 基因被鑒定為關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)：抑制其表達(dá)可使 FFA 產(chǎn)量從 747 mg/L 提升至 2992 mg/L。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，pcnB的抑制顯著增強(qiáng)了質(zhì)子消耗系統(tǒng)（GAD 系統(tǒng)）基因（如 gadA、gadX、gadE）的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。通過減少 RNA 多聚腺苷酸化酶介導(dǎo)的降解，細(xì)胞在 FFA 合成過程中能更高效地中和胞內(nèi)質(zhì)子，從而緩解膜損傷、降低活性氧（ROS）水平并提升 ATP 供給，為高產(chǎn)表型奠定了生理基礎(chǔ)。
為突破單基因調(diào)控的極限，團(tuán)隊(duì)在 pcnB 抑制菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行了第二輪全基因組 CRISPRi 篩選，從中發(fā)現(xiàn)外排泵基因 acrD 的協(xié)同增效作用。單獨(dú)抑制 acrD 會(huì)導(dǎo)致膜完整性下降，但將其與 pcnB 抑制聯(lián)用時(shí)，acrD 的抑制反而釋放了更多外膜通道蛋白 TolC 資源，促使 AcrB 依賴的 FFA 外排效率提升至 80%。掃描電鏡（SEM）顯示，雙基因抑制菌株（pcnBi-acrDi）細(xì)胞形態(tài)完整，膜損傷顯著緩解。這一組合策略使 FFA 產(chǎn)量進(jìn)一步增加 33%，達(dá)到 4120 mg/L，凸顯了生理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同優(yōu)化潛力。
圖 | 單獨(dú)抑制 acrD 產(chǎn)量反而低，但它和 pcnB 抑制配合后，能夠提升 FFA 產(chǎn)量
基于上述發(fā)現(xiàn)，團(tuán)隊(duì)最終引入脂肪酸合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 FadR的組成型過表達(dá)，構(gòu)建出三基因工程菌株pcnBi-acrDi-fadR+。在 5 L 發(fā)酵罐中，該菌株表現(xiàn)出卓越的生產(chǎn)性能：41.7 小時(shí)內(nèi) FFA 產(chǎn)量達(dá) 35.1 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為 0.84 g/L/h，碳轉(zhuǎn)化率為 0.20 g/g 甘油。這一數(shù)據(jù)較已報(bào)道的產(chǎn)油酵母（如 Yarrowia lipolytica 9.67 g/L）、模式絲狀真菌（如 Rhodococcus opacus 50.2 g/L）展現(xiàn)出更高效的能量代謝適配性，且生產(chǎn)效率達(dá)到放線菌的 1.76 倍。離心后發(fā)酵液頂部可見明顯 FFA 油層，印證了其工業(yè)化分離的可行性。
從科學(xué)視角看，該研究突破了傳統(tǒng)代謝工程對(duì)“單一通路優(yōu)化”的路徑依賴，首次通過全基因組篩選揭示非經(jīng)典生理調(diào)控基因（pcnB、acrD）對(duì)生物合成的全局影響。pcnB 作為 RNA 代謝全局調(diào)控因子，其抑制引發(fā)的轉(zhuǎn)錄組重塑為理解微生物應(yīng)激響應(yīng)提供了新視角；而 acrD 與 pcnB 的協(xié)同效應(yīng)，則證明了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞生理狀態(tài)的動(dòng)態(tài)耦合機(jī)制。
產(chǎn)業(yè)應(yīng)用方面，該工程菌株的 FFA 生產(chǎn)效率已達(dá)到傳統(tǒng)酯交換法生產(chǎn)生物柴油的原料需求閾值。結(jié)合大腸桿菌快速生長(zhǎng)、易規(guī)?；囵B(yǎng)的特性，未來可通過發(fā)酵工藝優(yōu)化進(jìn)一步降低成本。研究團(tuán)隊(duì)指出，下一步將探索該策略在長(zhǎng)鏈脂肪酸、羥基脂肪酸等特種化學(xué)品合成中的普適性，并開發(fā)配套的提取純化工藝。
1.Fang, L., Hao, X., Fan, J. et al. Genome-scale CRISPRi screen identifies pcnB repression conferring improved physiology for overproduction of free fatty acids in Escherichia coli. Nat Commun 16, 3060 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-58368-3
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