文章摘要
軟骨作為高含水量的承重組織，具有優(yōu)良的彈性和高強度。然而，開發(fā)軟骨適應(yīng)性生物材料來替代或再生受損的軟骨組織仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。作者將蛋白質(zhì)模板化和機械訓(xùn)練相結(jié)合，制備了具有與軟骨相似的機械性能和含水量的晶體介導(dǎo)的殼聚糖納米纖維水凝膠（O-CN凝膠）。O-CN凝膠的水含量為1.74 wt%，具有高的拉伸強度（1.154 MPa）和楊氏模量（1.241 MPa），以及優(yōu)異的生物相容性，抗溶脹性和抗菌能力。O-CN凝膠植入大鼠尾椎纖維環(huán)缺損模型后，可封閉軟骨（纖維環(huán)）缺損，維持椎間盤高度，最終防止髓核突出。這種蛋白質(zhì)模板和機械訓(xùn)練的協(xié)同策略為設(shè)計高度機械的水凝膠開辟了新的可能性，特別是用于承重組織的替換和再生。。
背景介紹
人體承重組織如骨骼肌、關(guān)節(jié)軟骨等，常因運動、負重等活動承受強烈機械應(yīng)力。高含水量的軟骨，例如，需承受特定范圍的彈性與壓縮模量運動。這些組織一旦受損，需借助強健力學性能的生物材料進行修復(fù)。水凝膠作為一種高含水量的三維網(wǎng)絡(luò)材料，在組織工程修復(fù)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。然而，大多數(shù)生物相容性水凝膠因機械性能不足，難以勝任承重組織的修復(fù)工作。盡管已采取多種策略來改善其機械性能，如化學/物理鍵耗散晶體結(jié)構(gòu)形成等，但這些方法仍無法同時實現(xiàn)優(yōu)異的機械性能與高保水性。例如，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠雖能通過物理交聯(lián)提升機械性能，但在軟骨工程修復(fù)中的表現(xiàn)仍顯不足；聚乙烯醇（PVA）凝膠雖展現(xiàn)出肌腱水平的拉伸性能，但其生物相容性卻令人擔憂；纏結(jié)工程化的蛋白質(zhì)水凝膠雖壓縮性能出色，但拉伸性能和水含量卻相對較低。殼聚糖作為一種天然堿性多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性和抗菌性，在組織工程中應(yīng)用廣泛。然而，殼聚糖膜在濕態(tài)下的機械性能較差，盡管可通過鹽析效應(yīng)等方法提高其力學性能，但低水含量仍限制了其在體內(nèi)組織工程中的應(yīng)用。未來，或可借助犧牲模板法開發(fā)3D網(wǎng)絡(luò)支架，為解決這一問題提供新思路。
結(jié)果與討論
圖1.晶體介導(dǎo)的取向殼聚糖納米原纖水凝膠（O-CN凝膠）的制備示意圖。
作者提出了一種新的協(xié)同策略，通過蛋白質(zhì)模板化和機械訓(xùn)練在殼聚糖水凝膠中實現(xiàn)組合的高機械性能和高含水量性能（圖1A）。該體系通過在堿性條件下犧牲蛋白質(zhì)體，將雙網(wǎng)絡(luò)殼聚糖/蛋白質(zhì)（明膠或絲素蛋白）水凝膠（DNCG凝膠）轉(zhuǎn)化為物理交聯(lián)的單網(wǎng)絡(luò)殼聚糖納米纖維水凝膠（CN凝膠），通過疏水作用和氫鍵作用形成晶體介導(dǎo)的無規(guī)CN水凝膠（R-CN凝膠）。在機械訓(xùn)練后，這些R-CN凝膠沿著拉伸方向排列以形成晶體介導(dǎo)的定向CN水凝膠（O-CN凝膠），其具有與軟骨（纖維環(huán)）的結(jié)構(gòu)相似性（圖1B）。這些O-CN凝膠表現(xiàn)出極高的拉伸強度、模量和斷裂韌性，達到軟骨水平的機械性能（圖1C）。此外，O-CN凝膠具有與軟骨的含水量相似的高含水量、優(yōu)異的生物相容性、抗菌性和抗溶脹性。
圖2CN凝膠的成分及形貌表征。
殼聚糖和明膠被用作模型系統(tǒng)，通過犧牲明膠配位網(wǎng)絡(luò)和機械訓(xùn)練來制備超高強度和富含水的O-CN凝膠（圖1A）。CG凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像具有大孔（圖2A）。ii）CG凝膠中的明膠網(wǎng)絡(luò)在用乙醇（EtOH）的部分脫水過程中變得更加緊密（圖2B）。此外，在乙醇處理條件下，CG凝膠中的殼聚糖鏈通過疏水相互作用形成網(wǎng)絡(luò)，從而形成雙網(wǎng)絡(luò)CG凝膠（DN CG凝膠）。在暴露于氫氧化鈉（NaOH）溶液時，產(chǎn)生具有光滑表面和隨機納米纖維的R-CN凝膠（圖2C）。所得R-CN凝膠是透明的，并且可以承受扭曲（圖2D）和打結(jié)（圖2 E）的變形。明膠的FTIR光譜顯示出三個特征峰：酰胺I帶、酰胺II帶（和酰胺III帶（圖2F）。殼聚糖粉末和殼聚糖-NaOH凝膠具有明顯的特征吸收峰，分別對應(yīng)于殼聚糖的酰胺I帶和NH 2吸收峰（圖2F）。在CG凝膠的情況下，酰胺帶中的峰位置與明膠相似（圖2F），而R-CN凝膠的峰與殼聚糖粉末和殼聚糖-NaOH凝膠相當。所得R-CN凝膠未顯示明膠的相關(guān)特征峰，這證明CG凝膠中明膠降解（圖2F）。為了進一步證明明膠在NaOH溶液中的降解，使用異硫氰酸熒光素標記的明膠（FITC-明膠）來構(gòu)建CG凝膠。如圖2G所示，NaOH浸泡溶液中FITC的熒光強度隨著FITC-明膠降解而增加，在120 min時達到最大熒光強度，這與初始重量的FITC-明膠的相同熒光強度一致（圖2 H）。綜上所述，上述結(jié)果表明DN CG凝膠中的明膠在NaOH溶液中被犧牲以形成單一網(wǎng)絡(luò)R-CN凝膠。最后，將R-CN凝膠沿著拉伸方向排列，以在機械訓(xùn)練后形成取向的納米原纖殼聚糖凝膠（O-CN凝膠）（圖2 I）。圖2 J顯示了R-CN凝膠的平滑表面，而O-CN凝膠在訓(xùn)練后表現(xiàn)出由互連取向的納米纖維組成的中孔網(wǎng)絡(luò)（圖2K）。此外，根據(jù)O-CN和R-CN凝膠的橫截面形態(tài)，與R-CN凝膠不同，O-CN凝膠顯示出圓形球體或圓形結(jié)構(gòu)（圖2 J;和圖2K）。
圖3.DN CG和R-CN凝膠的機械性能表征。
當在EtOH中處理時間增加時，DN CG凝膠的拉伸強度也增加（圖3A）。這種力學性能的提高主要歸因于CG凝膠的明膠化，因為明膠在與EtOH的部分脫水過程中可以形成更強的內(nèi)部氫鍵。如圖3B所示，隨著NaOH處理時間增加，R-CN凝膠的拉伸強度也增加，而R-CN凝膠的模量幾乎保持不變。當NaOH濃度增加時，R-CN凝膠的斷裂韌性和拉伸應(yīng)變下降（圖3C）。這種力學性能的下降主要是由于R-CN凝膠在高濃度NaOH溶液中的物理交聯(lián)密度過大，影響了殼聚糖鏈的纏結(jié)和殼聚糖晶體的形成。所開發(fā)的R-CN凝膠具有顯著的承重能力，可承受1 kg重量（圖3D），而明膠或殼聚糖-NaOH凝膠太弱且易碎，無法承受此重量。對于以下實驗，從用1 m NaOH處理24小時的CG水凝膠獲得R-CN凝膠。R-CN凝膠不僅具有優(yōu)異的拉伸性能，而且在80%壓縮應(yīng)變下顯示出21.2 MPa的應(yīng)力（圖3E）。在該壓縮條件下，R-CN凝膠保持完整形狀，而CG凝膠容易破裂（圖3F）。R-CN凝膠能夠在40%壓縮應(yīng)變下承受10000次連續(xù)壓縮-松弛循環(huán)，載荷損失小于35%（圖3G）。在10000次連續(xù)壓縮-松弛循環(huán)后，R-CN凝膠的壓縮模量增加，R-CN凝膠的壓縮應(yīng)力也對應(yīng)提高（圖3 H）。這些結(jié)果表明，R-CN凝膠可以實現(xiàn)高的機械性能，通過氫鍵和疏水相互作用的殼聚糖納米纖維鏈與NaOH處理。通常，水凝膠具有高機械性能，但保水性低。然而，所獲得的R-CN凝膠保持75重量%的相對高的水含量（圖3 I）。
圖4 機械訓(xùn)練后O-CN凝膠的力學性能表征。
拉伸測試在O-CN凝膠上以平行（平行）和垂直（垂直）取向與對齊的納米纖維進行（圖4A）。O-CN凝膠（OCN）的拉伸強度為，幾乎是O-CN凝膠（OCN）的拉伸強度的三倍（圖4 B）。O-CN的模量和斷裂韌性。O-CN凝膠（OCN）的模量和斷裂韌性也高于O-CN凝膠（OCN）（圖4C、D）。此外，與R-CN凝膠相比，O-CN凝膠的拉伸強度從11.8 MPa增加到15.4 MPa，模量從4.2 MPa增加到24.1 MPa，斷裂韌性從8.5 MJ m ? 3增加到13.4 MJ m?3，使其能夠承受2 kg的重量（圖4 E）。O-CN凝膠的機械性能的這些增強可以歸因于結(jié)晶區(qū)域的重排和相鄰的殼聚糖鏈之間的氫鍵的增加，從而導(dǎo)致在機械訓(xùn)練后密集堆積的殼聚糖納米纖維和水合殼聚糖晶體。作者比較了不同水含量下殼聚糖基水凝膠和常用材料的拉伸強度（圖4F），作者觀察到制備的O-CN凝膠表現(xiàn)出更高的拉伸強度和彈性模量，幾乎匹配軟骨的機械性質(zhì)（圖4G）。高含水量和抗溶脹性能使O-CN凝膠非常適合應(yīng)用于軟骨工程修復(fù)。
圖5. CN凝膠上的晶體排列表征。
20 °和8.2°的相同峰對應(yīng)于殼聚糖晶體的（020）反射和（200）/（220）反射（圖5A）。與R-CN凝膠相比，O-CN凝膠在20°處的峰變窄，表明機械訓(xùn)練后O-CN凝膠的晶體尺寸增加。圖5 B顯示R-CN凝膠的熱分解溫度為194 °C，而O-CN凝膠的溫度為220 °C。這些結(jié)果表明，與R-CN凝膠相比，O-CN凝膠表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。R-CN凝膠顯示出各向同性的Debye-Scherrer環(huán)，其峰為（200/200），表明晶體的隨機排列（圖5C，i）。隨著機械訓(xùn)練期間的循環(huán)力從10 N增加到50 N，O-CN凝膠的（200/200）反射變得更強，表明殼聚糖晶體的重排和O-CN凝膠的增強的各向異性（圖5C）。同時，O-CN凝膠的強度和取向因子（f）也增加（圖5D、E），進一步表明隨著力的增加，取向得到改善?？偟膩碚f，O-CN凝膠具有高的機械性能，這是由于CN凝膠的結(jié)晶區(qū)域在機械訓(xùn)練后的重排。
圖6. 大鼠模型中O-CN凝膠的放射學評估。
為了探索O-CN凝膠在體內(nèi)促進纖維環(huán)修復(fù)的效率，作者在大鼠中建立了尾椎缺損模型。治療后4周和8周，采用放射學和組織學評估評價椎間盤退變（圖6A）。與對照組相比，O-CN凝膠在DHI方面表現(xiàn)出顯著差異，而在治療4周時，在O-CN凝膠組和假手術(shù)組之間未觀察到顯著差異（圖6 B、C）。術(shù)后8周后，與對照組相比，O-CN凝膠組顯示出更大的椎間盤高度保留，表明O-CN凝膠治療有效緩解了IVD退變的進展（圖6D）。然后，進行T2加權(quán)共振成像（MRI），以評價核的含水量（圖6 E）。O-CN凝膠組的含水量與假手術(shù)組相似，但在治療4周后顯著高于對照組（圖6 F）。隨著時間的推移，O-CN凝膠組和對照組之間的含水量差異顯著增加，在術(shù)后8周時變得更加顯著（圖6 G）。Pfirrmann分類顯示，在4周和8周時，與對照組相比，O-CN凝膠組的瓣膜退行性變程度較低（圖6 H，I）。這些影像學結(jié)果表明，與對照組相比，O-CN凝膠在延遲瓣膜隨時間的退變方面具有顯著優(yōu)勢。
圖7.大鼠模型中O-CN凝膠的組織學評價。
在8周椎間盤切除術(shù)后，對照組中存在嚴重破壞伴髓核突出（圖7A）。在給藥后4周和8周后，對照組嚴重萎縮，蛋白聚糖區(qū)顏色較淺，而O-CN凝膠組輕微退化，與假手術(shù)組相似（圖7 B）。為了進一步評價椎間盤的修復(fù)效率，使用免疫組織化學分析評估聚集蛋白聚糖（ACAN）和I型膠原（Col I）的表達水平（圖7 C、D）。假手術(shù)組和O-CN凝膠組在第4周和第8周時顯示出最低等級，表明瓣膜變性較少（圖7 E-G）?？傊?，這些組織學發(fā)現(xiàn)證明原位植入O-CN凝膠有效地愈合了環(huán)缺損并減輕了椎間盤的退變。
圖8. 高強度CN凝膠設(shè)計的通用方法。
作者推測其他蛋白質(zhì)也可以作為犧牲體來制備高強度CN凝膠。為了驗證這種可預(yù)測的一般性，作者使用絲素蛋白來制造CN凝膠。FTIR圖像顯示了絲纖蛋白在NaOH溶液中的降解（圖8A）。采用Cy5.5-標記絲素蛋白追蹤降解過程（圖8B）。結(jié)果表明，標記的絲纖維在90分鐘內(nèi)降解。SEM表征表明，所得R-CN（SF）凝膠顯示出粗糙的表面（圖8 C），而O-CN（SF）凝膠在機械訓(xùn)練后顯示出粗糙的纖維表面（圖8D），呈現(xiàn)出與使用明膠犧牲制備的R-CN凝膠和O-CN凝膠相似的趨勢。O-CN（SF）凝膠的楊氏模量、斷裂韌性、拉伸強度和應(yīng)變分別達到10.6 MPa、10.6 MJm-3、12.8 MPa和193%（圖8 E），其也可以承受1 kg的重量（圖8 F）。與O-CN凝膠相比，O-CN（SF）凝膠的力學性能較低，這可能是由于明膠和絲纖維之間氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)的差異造成的然而，當與其他物理或化學交聯(lián)殼聚糖/絲纖蛋白凝膠相比時，O-CN（SF）凝膠具有優(yōu)異的保水性和優(yōu)異的機械性能，使它們更好地與軟骨的力學相匹配（圖8 G）。因此，犧牲網(wǎng)絡(luò)和機械訓(xùn)練策略可以應(yīng)用于不同的蛋白質(zhì)，以制造高強度CN凝膠。
文章總結(jié)
綜上，作者成功地開發(fā)了一種新的方法，通過結(jié)合犧牲天然網(wǎng)絡(luò)體與機械訓(xùn)練過程來制備超強和高含水量的O-CN凝膠。明膠在氫氧化鈉溶液中降解形成晶體介導(dǎo)的無規(guī)凝膠（R-CN凝膠）。經(jīng)過機械訓(xùn)練后，R-CN凝膠沿拉伸方向沿著排列，導(dǎo)致高拉伸強度（15.4 MPa）、模量（24.1 MPa）和斷裂韌性（13.4 MJ m?3）的O-CN凝膠的再生。此外，該方法還使O-CN凝膠具有較高的含水量（約74wt%）、良好的生物相容性、抗菌性和抗溶脹性。該方法的通用性通過其對明膠和絲素蛋白作為犧牲網(wǎng)絡(luò)的適用性來證明。卓越的機械性能、高含水量和抗溶脹特性使這些O-CN凝膠非常適合軟骨修復(fù)。最終，所得到的OCN凝膠可以防止核突出，保持高水化，并通過大鼠尾椎缺損保持椎間盤高度，顯示出負載軟骨工程的潛力。未來的努力可以針對定制的OCN凝膠的性能，以滿足在大型動物模型中的組織工程的特定要求。
文章信息
Zhou D, Wang W, Ma W, et al. Cartilage‐Adaptive Hydrogels via the Synergy Strategy of Protein Templating and Mechanical Training[J].
Adv. Mater.2025, 2414081.
來源：超分子光化學與自組裝
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