類器官（Organoid）已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的“明星模型”，在疾病機(jī)制研究、藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)療等方面展現(xiàn)出巨大潛力。然而，許多科研人員在嘗試類器官培養(yǎng)時(shí)，常常面臨“無法形成結(jié)構(gòu)”、“細(xì)胞活性低”、“傳代失敗”等問題。
探究其根本，培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的選擇和配比可能是成敗的關(guān)鍵！
接下來，我們將會(huì)結(jié)合類器官經(jīng)典培養(yǎng)方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大護(hù)法”如何各顯神通，助你攻克類器官培養(yǎng)難關(guān)！
類器官的經(jīng)典培養(yǎng)方案WENR（或稱為WNER）最初由類器官之父、荷蘭Hubrecht研究所的Hans Clevers教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)，其核心成分包括 Wnt-3a、EGF、Noggin 和 R-Spondins，常被稱為類器官培養(yǎng)的“四大護(hù)法”。
WENR 方案在類器官的研究與實(shí)踐中不斷演化，通過與其他細(xì)胞因子或小分子抑制劑的巧妙結(jié)合，衍生出適用于多種類器官構(gòu)建的培養(yǎng)條件。目前，WENR 方案已在胃、小腸、結(jié)腸、胰腺、肝臟等多種類器官培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。
WENR方案用于多種類器官培養(yǎng)（源自Bindi M. Doshi, PhD. www.labroots.com）
WENR“四大護(hù)法”
WENR 方案源于對(duì)干細(xì)胞微環(huán)境的深度解析。研究發(fā)現(xiàn)，腸道、肝臟、胰腺等器官的干細(xì)胞生態(tài)位中，Wnt 信號(hào)通路、EGF 信號(hào)通路、BMP 信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)平衡是維持干細(xì)胞自我更新與分化的關(guān)鍵。通過模擬這一微環(huán)境，科學(xué)家篩選出這四類核心因子。
WENR方案在肺類器官培養(yǎng)中的作用（源自文獻(xiàn)：doi: 10.3390/cancers14092144）
Wnt-3a：干細(xì)胞增殖的“發(fā)動(dòng)機(jī)”
Wnt-3a 作為經(jīng)典 Wnt 通路的激活劑，通過穩(wěn)定 β-catenin 蛋白，啟動(dòng)下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），參與細(xì)胞發(fā)育、增殖和分化過程。Alessandra Merenda在其綜述中深入總結(jié)了Wnt信號(hào)通路在類器官領(lǐng)域的關(guān)鍵作用。文中指出，無論成體干細(xì)胞組織來源如何，其衍生的類器官在增殖、干性維持及終末分化特化細(xì)胞等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，都依賴于經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路。如在小鼠結(jié)腸類器官的建立過程中，添加外源性 Wnt-3a 對(duì)于其增殖至關(guān)重要。而不添加 Wnt-3a，類器官超過 3 天后無法存活。
Wnt-3a在腸類器官中培養(yǎng)中的作用（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）
EGF：細(xì)胞增殖的“加速器”
表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與受體結(jié)合，激活 MAPK/ERK 通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。EGF 刺激上皮細(xì)胞增殖、血管生成和表皮細(xì)胞分化，促進(jìn)類器官三維結(jié)構(gòu)的形成。EGF 廣泛應(yīng)用于胃腸道、肝臟、甲狀腺等類器官培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞集落形成和組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。盡管 EGF 并非類器官形成的必需因子，但能顯著增加類器官體積。
優(yōu)化的WENR方案在人胃腸道類器官構(gòu)建過程中的應(yīng)用（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）
Noggin：抑制分化的“守門員”
Noggin是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的內(nèi)源性抑制劑，通過阻斷 BMP 與受體結(jié)合，促進(jìn)干細(xì)胞增殖，為類器官形成提供充足的細(xì)胞。Noggin 還通過抑制 BMP 信號(hào)通路，維持干細(xì)胞干性，影響細(xì)胞的命運(yùn)決定和分化過程。在類器官培養(yǎng)中，Noggin 常與 Wnt-3a 和 R-Spondins 一起使用，以平衡 BMP 和 Wnt 信號(hào)通路，促進(jìn)類器官的生長(zhǎng)和分化。因此，Noggin 在類器官培養(yǎng)中不僅促進(jìn)增殖，還精細(xì)調(diào)控細(xì)胞的分化。
Noggin抑制細(xì)胞增殖的分子機(jī)制（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1242/bio.20149977）
R-Spondins：Wnt信號(hào)的“放大器”
R-spondin 是 Wnt 信號(hào)通路的激活劑，通過與 Frizzled 和 LRP5/6 受體結(jié)合，增強(qiáng) Wnt 信號(hào)在多種組織中的表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞增殖與類器官結(jié)構(gòu)形成。T. Thalheim等人發(fā)現(xiàn)，沒有 R-spondin 存在時(shí)，類器官在 4-5 天后停止生長(zhǎng)。在 1.2% R-spondin 濃度下培養(yǎng)的類器官生長(zhǎng)非常迅速，生長(zhǎng)時(shí)間超過 5 天后經(jīng)常破裂，其管腔內(nèi)積累了大量細(xì)胞碎片。在 10% 或 25% 的 R-spondin 濃度下培養(yǎng)的類器官生長(zhǎng)速度比 1.2% 稍慢，但不會(huì)破裂。
不同濃度的R-spondin影響腸類器官的生長(zhǎng)狀態(tài)（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）
WENR經(jīng)典方案使用小Tips
Wnt 過度激活會(huì)導(dǎo)致類器官結(jié)構(gòu)紊亂，因此 Wnt-3a 濃度需嚴(yán)格控制。并且 R-spondin 需要和 Wnt-3a 協(xié)同使用，單獨(dú)使用效果有限。建議根據(jù)類器官類型優(yōu)化 Wnt-3a 的濃度，一般為 50-100 ng/mL。在培養(yǎng)后期也可以動(dòng)態(tài)調(diào)控其濃度。
EGF 易被蛋白酶降解，建議使用無血清培養(yǎng)基。EGF 長(zhǎng)期高濃度，可能會(huì)誘導(dǎo)異常分化，建議定期更換培養(yǎng)基。EGF 一般使用濃度為 50 ng/mL。在腫瘤類器官（如腸癌）中，其濃度需根據(jù)癌細(xì)胞特性調(diào)整。
Noggin 與 Wnt-3a 協(xié)同作用，支持胃、腸道、肝臟、肺、胰腺等類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)。在肺類器官培養(yǎng)中，Noggin 缺失會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞過早分化。在肝類器官中，其與 Wnt3a 的“雙劍合璧”是長(zhǎng)期傳代的關(guān)鍵。BMP 信號(hào)的過度激活會(huì)導(dǎo)致類器官形成囊狀結(jié)構(gòu)，失去功能性隱窩結(jié)構(gòu)。
R-spondin 有4個(gè)亞型（RSPO 1-4），不同組織來源的類器官可能需特異性選擇。Wnt-3a 和 R-spondin 易失活，建議分裝后 -80℃ 保存。
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