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【寫在前面】：本期推薦的是由上海中醫(yī)藥大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示黃芪桂枝五物湯通過(guò)AMPK/ TrkA/TRPM7通路緩解糖尿病心血管自主神經(jīng)病變。

【期刊簡(jiǎn)介】

【題目及作者信息】

Huangqi Guizhi Wuwu Decoction alleviates diabetic cardiovascular autonomic neuropathy via AMPK/TrkA/TRPM7 pathway

民族藥理學(xué)相關(guān)性：糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（DCAN）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，顯著增加了心血管疾病死亡的風(fēng)險(xiǎn)。黃芪桂枝五物湯（HGWD）已被證明對(duì)DCAN有效，但其潛在機(jī)制尚不明確。

研究目的：觀察HGWD對(duì)DCAN的臨床療效，并通過(guò)動(dòng)物模型闡明其潛在機(jī)制。

材料與方法：本研究共招募了202名符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)，并隨機(jī)分為兩組。使用美托洛爾作為陽(yáng)性對(duì)照藥。觀察HGWD對(duì)DCAN患者心率變異性的影響。為了進(jìn)一步闡明其潛在機(jī)制，通過(guò)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）測(cè)定了HGWD中7種主要成分的含量。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接預(yù)測(cè)HGWD治療DCAN的潛在機(jī)制。采用高脂飲食（HFD）和鏈脲佐菌素（STZ）注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。造模成功后，用含有TRPM7重組質(zhì)粒的腺相關(guān)病毒載體（pAAV-TRPM7）對(duì)大鼠進(jìn)行4周的預(yù)處理。

結(jié)果：臨床研究表明，HGWD能減少室性早搏次數(shù)，改善心率變異性，糾正DCAN患者心臟自主神經(jīng)的不平衡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，HGWD降低了糖尿病大鼠對(duì)心律失常的易感性，改善了糖尿病誘導(dǎo)的心肌纖維化，抑制了心臟自主神經(jīng)重塑，并促進(jìn)了糖尿病大鼠心臟交感神經(jīng)的修復(fù)。從機(jī)制上講，HGWD通過(guò)上調(diào)AMPK / TrkA通路，從而抑制TRPM7通道，對(duì)DCAN產(chǎn)生了改善作用。

結(jié)論：HGWD通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK / TrkA / TRPM7通路，抑制心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的重塑，降低室性心律失常的易感性，并改善DCAN，為其臨床應(yīng)用提供了有力支持。

（圖文摘要）

【前言】

糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（DCAN）是糖尿病微血管并發(fā)癥中的一種自主神經(jīng)病變，其特征是調(diào)節(jié)心臟和血管的自主神經(jīng)纖維受損。這會(huì)導(dǎo)致交感和副交感神經(jīng)之間的平衡失調(diào)，進(jìn)而引起心率和血液動(dòng)力學(xué)異常。長(zhǎng)期高血糖會(huì)引發(fā)心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的神經(jīng)重塑，擾亂心臟電生理和復(fù)極離散度，并且是糖尿病相關(guān)致命性心律失常發(fā)生的關(guān)鍵因素。臨床流行病學(xué)研究顯示，約60%的糖尿病患者會(huì)并發(fā)DCAN，其室性心律失常和心臟性猝死的發(fā)生率是非糖尿病患者的約5倍。這凸顯了糖尿病對(duì)患者長(zhǎng)期預(yù)后的重大威脅。目前，DCAN的確切病理機(jī)制尚不明確，臨床管理主要圍繞癥狀控制展開，通常采用β受體阻滯劑、心肌代謝增強(qiáng)劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物，并結(jié)合嚴(yán)格的血糖控制。然而，由于心臟自主神經(jīng)之間的復(fù)雜協(xié)同和拮抗關(guān)系，臨床上的單一藥物治療往往難以有效解決心臟自主神經(jīng)的重塑問(wèn)題。因此，迫切需要更有效的治療策略，以最大化臨床獲益并改善預(yù)后。

有趣的是，5'-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）已被確定為葡萄糖的高敏感受體，它能夠?qū)⒛芰扛袘?yīng)機(jī)制與代謝途徑聯(lián)系起來(lái)。多項(xiàng)研究已證實(shí)AMPK在調(diào)節(jié)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥（包括心臟問(wèn)題和糖尿病神經(jīng)病變）方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。胰島素受體底物（IRS）的Ser789位點(diǎn)作為Trk受體信號(hào)適配蛋白，可被AMPK磷酸化，從而調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)事件。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）在心臟再神經(jīng)支配中起決定性作用，對(duì)交感神經(jīng)再生和過(guò)度神經(jīng)支配至關(guān)重要。酪氨酸激酶受體A（TrkA）是NGF的高親和力受體。被NGF激活的TrkA通過(guò)PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元中TRPM7的表達(dá)。

TRPM7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，在心臟中高表達(dá)，并在胚胎發(fā)育期間的心肌細(xì)胞中高度集中。眾多研究表明，沉默TRPM7不僅抑制空腹胰島素降低和胰腺β細(xì)胞抗體水平升高，還能預(yù)防高血糖引起的血管內(nèi)皮損傷和神經(jīng)元死亡。此外，TRPM7通道通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2 +和Mg2 +的平衡發(fā)揮抗心律失常和抗心肌纖維化作用。抑制TRPM7是DCAN的潛在治療策略，但糖尿病心臟神經(jīng)中TRPM7的變化和作用尚不清楚。

然而，由于DCAN病理過(guò)程的復(fù)雜性，使用單一機(jī)制藥物難以實(shí)現(xiàn)全面和系統(tǒng)的心臟保護(hù)。中藥方劑作為輔助醫(yī)學(xué)的重要組成部分和心血管藥物發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源，因其多種活性和有效成分的協(xié)同作用而越來(lái)越受到關(guān)注。

黃芪桂枝五物湯（HGWD）是公元3世紀(jì)初《金匱要略》中的經(jīng)典傳統(tǒng)中藥方劑，用于治療與DCAN臨床表現(xiàn)相同的血瘀癥，并在糖尿病神經(jīng)病變的治療中顯示出明確且精準(zhǔn)的療效。從中醫(yī)角度看，DCAN的發(fā)病機(jī)制可以從營(yíng)衛(wèi)不和的角度來(lái)理解。HGWD被認(rèn)為具有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的功能。HGWD由黃芪、桂枝、白芍、生姜和大棗按1:1:1:2:1.1的比例組成。研究表明，HGWD中的活性成分芍藥苷可激活A(yù)MPK通道，而黃芪皂苷IV可抑制TRPM7通道。然而，HGWD在改善DCAN方面的藥理作用和機(jī)制尚不明確。鑒于AMPK與糖尿病相關(guān)神經(jīng)病變有關(guān)，我們假設(shè)激活A(yù)MPK可能磷酸化TrkA，從而抑制TRPM7信號(hào)傳導(dǎo)，延緩糖尿病心臟自主神經(jīng)重塑。

本研究采用系統(tǒng)方法，通過(guò)隨機(jī)臨床試驗(yàn)、超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）分析、生物信息學(xué)、基因過(guò)表達(dá)模型和多種藥理實(shí)驗(yàn)，全面探討HGWD對(duì)DCAN的治療效果。我們對(duì)HGWD的研究為推進(jìn)DCAN新藥研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，闡明了HGWD治療DCAN的機(jī)制，并為未來(lái)HGWD研究提供了創(chuàng)新方向。

【結(jié)果】

臨床研究：研究對(duì)象特征（臨床數(shù)據(jù)證明HGWD與美托洛爾療效相當(dāng)）

本研究共招募202名患者參與臨床試驗(yàn)，按1:1比例隨機(jī)分為對(duì)照組（使用美托洛爾和標(biāo)準(zhǔn)治療）和HGWD組（使用HGWD和標(biāo)準(zhǔn)治療）。觀察期間，對(duì)照組3人、HGWD組2人因失訪被排除，HGWD組另有3人拒絕治療被排除。最終194名患者完成試驗(yàn)，其中HGWD組95人，對(duì)照組99人?；颊呋€特征見表2，兩組基線數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異。

臨床研究：HGWD治療改善DCAN患者的心率變異性

SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50水平反映心臟自主功能。SDNN和SDANN水平與交感神經(jīng)活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)，RMSSD和pNN50水平與副交感神經(jīng)活動(dòng)呈正相關(guān)。治療后，兩組HbA1c水平和室性早搏次數(shù)顯著下降（P < 0.05，P < 0.01），SDNN、SDANN和pNN50水平不同程度升高。但對(duì)照組治療后RMSSD水平與治療前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表3和表4）。此外，HGWD組治療后SDNN、RMSSD和pNN50的上調(diào)幅度大于對(duì)照組（P < 0.05）（表5）。

1、HGWD抑制STZ誘導(dǎo)的心律失常和心肌重塑易感性

采用PES和心電圖評(píng)估HGWD對(duì)心律失常易感性的影響。結(jié)果顯示，模型組PES后易發(fā)生多種心律失常，包括室性早搏和室性心動(dòng)過(guò)速，室性心律失常發(fā)生率顯著高于對(duì)照組（P < 0.05），表明模型組心律失常易感性增加。相比之下，HGWD以劑量依賴性方式降低PES后心律失常和室性心律失常的發(fā)生率，提示HGWD可有效降低糖尿病心律失常的發(fā)生率（圖1A和B）。隨后，采用組織病理學(xué)方法評(píng)估HGWD對(duì)糖尿病大鼠的影響。H&E染色結(jié)果顯示，HGWD可改善心肌纖維化。對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列有序、大小正常、形態(tài)規(guī)則，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組心肌細(xì)胞大小不一、排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊，并有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

HGWD治療后，心肌細(xì)胞排列更有序，體積減小，形態(tài)清晰（圖1C）。STZ干預(yù)使心肌纖維化標(biāo)志物表達(dá)異常增加。因此，采用Masson染色定量評(píng)估心肌纖維化程度。結(jié)果顯示，模型組心肌組織中膠原纖維面積顯著增加，增殖廣泛，盤繞成網(wǎng)并不規(guī)則地包圍心肌纖維組織。而HGWD組心肌纖維排列整齊，無(wú)斷裂，HGWD顯著以劑量依賴性方式減少心肌組織中膠原纖維面積（圖1D和E）。

HGWD抑制糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)重塑并促進(jìn)心臟交感神經(jīng)修復(fù)

通過(guò)免疫組化、RT-qPCR和Western Blot評(píng)估心臟自主神經(jīng)再生標(biāo)志物（TH、ChAT和GAP-43）水平，確定HGWD對(duì)糖尿病自主神經(jīng)病變的影響。既往研究表明，TH和ChAT陽(yáng)性表達(dá)分別代表心臟交感和副交感神經(jīng)分布，GAP-43可用于評(píng)估心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)活性。免疫組化結(jié)果顯示，模型組心肌組織中TH、ChAT和GAP-43陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布顯著增加，以及上頸交感神經(jīng)節(jié)中GAP-43陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布增加。HGWD組陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布面積顯著減少，高劑量組減少更明顯（圖1F-I）。

2、 HGWD 中主要成分的定量分析

3、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè) HGWD 治療 DCAN 的機(jī)制

基于 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和 UPLC-MS 分析，確定 HGWD 的 75 種活性成分。獲得與 HGWD 成分相關(guān)的 1728 個(gè)靶點(diǎn)以及 DCAN 的 1906 個(gè)潛在靶點(diǎn)。隨后，確定其中 276 個(gè)靶點(diǎn)為 HGWD 治療 DCAN 的潛在治療靶點(diǎn)（圖 3A）。通過(guò) Cytoscape 3.6.0 分析發(fā)現(xiàn)，有 60 個(gè)核心靶點(diǎn)的度值≥10（圖 3B）。對(duì)這 60 個(gè)核心治療靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。根據(jù) GO 富集分析，HGWD 對(duì) DCAN 的分子功能涉及蛋白激酶結(jié)合和蛋白激酶活性。生物過(guò)程與細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)和對(duì)激素的反應(yīng)有關(guān)。細(xì)胞組分與膜筏和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體等有關(guān)（圖 3C 和 D）。此外，KEGG 分析表明，HGWD 治療 DCAN 可能與 AMPK 信號(hào)通路有關(guān)（圖 3E）。

4、基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè) HGWD 中活性成分與 AMPK 靶點(diǎn)的相互作用

采用分子對(duì)接和表面等離子體共振（SPR）技術(shù)，確定 HGWD 中的 7 種活性成分與 AMPK 的特異性結(jié)合模式和親和力。在分子對(duì)接過(guò)程中，調(diào)整它們的構(gòu)象以結(jié)合到不同的蛋白質(zhì)空腔中，每組對(duì)接運(yùn)行重復(fù) 3 次。我們計(jì)算了平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果顯示大多數(shù)關(guān)鍵成分對(duì)靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合特性（表 6），并選擇對(duì)接結(jié)果的最佳結(jié)合模式進(jìn)行三維可視化（圖 4）。其中，芍藥苷通過(guò)與 AMPK 的 PHE-27、ASN-162、LYS-60、LYS-141 和 THR-26 形成氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為 -7.27±0.35 千卡 / 摩爾，抑制常數(shù)（Ki）為 4.65 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 35.73 微摩爾。木蝴蝶素通過(guò)與 AMPK 的 GLY-28、GLY-27、ASP-157 和 GLY-25 形成氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為 -7.07±0.12 千卡 / 摩爾，Ki 為 6.55 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 0.28 微摩爾。

黃芪皂苷 IV 通過(guò)與 AMPK 的 PHE-27 和 GLY-28 形成氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為 -7.73±0.15 千卡 / 摩爾，Ki 為 2.15 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 7.31 微摩爾。桂皮醛通過(guò)形成 3 個(gè)氫鍵與 AMPK 結(jié)合，結(jié)合能為 -5.13±0.12 千卡 / 摩爾，Ki 為 1.72 微摩爾，SPR 結(jié)合能 KD 為 0.01 微摩爾。其中，芍藥苷、木蝴蝶素和黃芪皂苷 IV 可以結(jié)合到 AMPK，并且具有快速結(jié)合和解離的特性。因此，很可能黃芪皂苷 IV 或芍藥苷和 AMPK 形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，這可以促進(jìn) PHE-27 與磷酸結(jié)合并發(fā)生磷酸化，從而激活 AMPK。同時(shí)，黃芪皂苷 IV 或木蝴蝶素也可能與 AMPK 形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這可以促進(jìn) GLY-28 與磷酸結(jié)合并發(fā)生磷酸化。上述結(jié)果預(yù)測(cè) AMPK 可能是 HGWD 活性成分對(duì) DCAN 保護(hù)作用的潛在靶點(diǎn)。

5、HGWD 通過(guò)調(diào)節(jié) AMPK/TrkA 通路抑制糖尿病心臟自主神經(jīng)病變

進(jìn)一步研究表明，在糖尿病模型中，AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平降低，而 HGWD 能夠逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)（圖 5A 和 B）。

基于上述分子對(duì)接和 SPR 結(jié)果，為了確定 HGWD 是否通過(guò)上調(diào) AMPK/TrkA 信號(hào)來(lái)改善 DCAN，我們使用 AMPK 抑制劑來(lái)消除 HGWD 在糖尿病模型中促進(jìn) AMPK 磷酸化的作用，并使用 AMPK 激動(dòng)劑來(lái)模擬 HGWD 促進(jìn) AMPK 磷酸化的效果。

結(jié)果表明，AMPK 激活后，糖尿病心律失常易感性降低，PES 后誘導(dǎo)室性心律失常的可能性降低。相反，抑制 AMPK 表達(dá)后，心律失常易感性增加。與 AMPK 抑制劑組相比，HGWD + AMPK 抑制劑組的心律失常易感性降低，這表明HGWD 通過(guò)激活 AMPK 抑制糖尿病心律失常易感性（圖 5C 和 D）。

免疫組化結(jié)果顯示，AMPK 激活減少了心肌組織中 TH 和 ChAT 陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布面積，而 AMPK 抑制則使相關(guān)陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布面積比模型組增加。此外，與 AMPK 抑制劑組相比，HGWD + AMPK 抑制劑組中所有陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布面積均有所減少（圖 5E 和 F）。Western Blot 顯示，與模型組相比，HGWD 組和 AMPK 激動(dòng)劑組中 AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平以及 NGF 表達(dá)水平升高，而 TH 和 ChAT 表達(dá)水平降低。相反，AMPK 抑制劑干預(yù)則產(chǎn)生相反的效果。與 AMPK 抑制劑組相比，HGWD 治療后 AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平以及 NGF 表達(dá)水平顯著升高，而 TH 和 ChAT 表達(dá)水平顯著降低（圖 5G 和 H）。這證實(shí)了 HGWD 通過(guò)激活 AMPK/TrkA 通路對(duì) DCAN 發(fā)揮治療作用的假設(shè)是可行的（進(jìn)一步論證）。

6、TRPM7 是糖尿病心血管自主神經(jīng)病變的關(guān)鍵介質(zhì)

研究表明，TrkA 受體與 TRPM7 在海馬神經(jīng)元上共定位，TrkA 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)缺血再灌注和氧糖剝奪期間海馬神經(jīng)元中 TRPM7 的表達(dá)。然而，TrkA 與 TRPM7 在 DCAN 中的關(guān)系尚未得到證實(shí)。首先，我們對(duì) TrkA 和 TRPM7 進(jìn)行了剛性蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)對(duì)接，以預(yù)測(cè)它們之間的關(guān)系。如圖 6A 和表 7 所示，TrkA 和 TRPM7 通過(guò)酪氨酸 104 - 谷氨酸 164 和組氨酸 108 - 谷氨酸 164 等氨基酸殘基位點(diǎn)形成氫鍵，表明兩者之間形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對(duì)接模型。

為了驗(yàn)證兩者之間的關(guān)系，我們使用了 TrkA 激動(dòng)劑（鹽酸阿米替林）和 TrkA 抑制劑（larotractinib）來(lái)觀察它們對(duì) TRPM7 的影響。Western blot 和免疫熒光結(jié)果顯示，模型組上頸交感神經(jīng)節(jié)中 TRPM7 水平顯著升高，HGWD 處理后 TRPM7 表達(dá)水平降低。而在 TrkA 抑制劑組中 TRPM7 水平升高，在 TrkA 激動(dòng)劑組中 TRPM7 水平降低。與 TrkA 抑制劑組相比，HGWD 處理顯著降低了 TRPM7 的表達(dá)水平（圖 6B–E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HGWD 可以通過(guò)上調(diào) TrkA 磷酸化水平來(lái)抑制 TRPM7 的表達(dá)，從而改善 DCAN（兩兩驗(yàn)證）。

7、 HGWD 通過(guò)調(diào)節(jié) AMPK/TrkA/TRPM7 信號(hào)通路降低心律失常易感性和抑制心肌纖維化

如圖 6BE 所示，與模型組相比，HGWD 干預(yù)后 TRPM7 水平顯著降低。為了進(jìn)一步證實(shí) HGWD 在 DCAN 中對(duì) TRPM7 的潛在調(diào)節(jié)作用，我們將 AAV-TRPM7 過(guò)表達(dá)病毒注入糖尿病大鼠的尾靜脈。15 天后，通過(guò) RT-qPCR 和 Western blot 驗(yàn)證了 TRPM7 的過(guò)表達(dá)效率（圖 7AB）。隨后，我們對(duì) HGWD 處理組進(jìn)行了觀察，以了解其對(duì)表型和蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，模型組心律失常易感性增加，PES 后更易誘發(fā)室性早搏和室性心動(dòng)過(guò)速。相比之下，TRPM7 抑制劑組心律失常的誘發(fā)率顯著降低，而 TRPM7-OE 組室性心律失常的誘發(fā)率顯著升高，這表明抑制 TRPM7 表達(dá)可以降低心律失常的易感性。此外，與 TRPM7-OE 組相比，HGWD + TRPM7-OE 組室性心律失常的發(fā)生率顯著降低，這表明 HGWD 逆轉(zhuǎn)了 TRPM7 激活引起的心臟易感性增加（圖 7CD）。

在組織病理學(xué)水平上，HE 染色結(jié)果顯示，TRPM7 抑制劑組細(xì)胞排列更有序，形態(tài)更清晰，而 TRPM7-OE 組心肌細(xì)胞排列紊亂，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和少量出血點(diǎn)。相反，HGWD + TRPM7-OE 組細(xì)胞排列有序，形態(tài)規(guī)則，體積較小，組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，無(wú)出血點(diǎn)（圖 7E）。Masson 染色結(jié)果顯示，與模型組相比，TRPM7 抑制劑組心肌組織中膠原纖維面積顯著減少，而 TRPM7-OE 組則顯著增加。經(jīng) HGWD 處理后，心肌組織的膠原纖維面積較 TRPM7-OE 組減少（圖 7F 和 G）。上述病理結(jié)果表明，TRPM7 過(guò)表達(dá)加劇了糖尿病心肌纖維化，而 HGWD 通過(guò)沉默 TRPM7 改善了心肌纖維化。

8、 HGWD 通過(guò)抑制 TRPM7 減輕糖尿病心臟自主神經(jīng)重塑并促進(jìn)心臟交感神經(jīng)修復(fù)

在糖尿病大鼠中激活 TRPM7 表達(dá)后，我們進(jìn)一步使用免疫組化和免疫熒光檢測(cè)心肌和交感神經(jīng)節(jié)組織中 TH、ChAT 和 GAP-43 的分布。這旨在探討 HGWD 在改善糖尿病自主神經(jīng)重塑效果中的潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，糖尿病心肌組織中 TH、GAP-43 和 ChAT 陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布增加。與模型組相比，TRPM7 抑制劑組中棕色染色的 TH、GAP-43 和 ChAT 陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布面積顯著減少，而 TRPM7-OE 組則顯著增加。同時(shí)，與 TRPM7-OE 組相比，HGWD 處理減少了 TH、GAP-43 和 ChAT 陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布面積，表明 HGWD 通過(guò)抑制 TRPM7 表達(dá)降低了心肌組織中 TH、ChAT 和 GAP-43 的表達(dá)水平（圖 8A 和 C）。

此外，免疫組化顯示，交感神經(jīng)節(jié)中 GAP-43 和 TRPM7 的分布趨勢(shì)與心肌組織中一致。與模型組相比，抑制 TRPM7 減少了交感神經(jīng)中 GAP-43 陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布，而激活 TRPM7 則增加了陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布。經(jīng) HGWD 處理后，陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布面積顯著減少，表明 HGWD 通過(guò)沉默 TRPM7 促進(jìn)交感神經(jīng)修復(fù)（圖 8B 和 D）。

9、在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，TH 和 ChAT 呈綠色，TRPM7 呈紅色。這些結(jié)果表明，DCAN 與 TRPM7 的上調(diào)有關(guān)。

與模型組相比，經(jīng) HGWD 和 TRPM7 抑制劑處理后，TH-TRPM7 和 ChAT-TRPM7 雙標(biāo)熒光強(qiáng)度降低，而 TRPM7-OE 組則顯著增強(qiáng)，表明 TRPM7 激活傾向于誘導(dǎo)糖尿病心臟自主神經(jīng)增生。此外，與 TRPM7-OE 組相比，HGWD + TRPM7-OE 組中 TH-TRPM7 和 ChAT-TRPM7 雙標(biāo)的熒光強(qiáng)度降低（圖 9）。

10、為了探討 HGWD 是否影響 TH 和 ChAT 的 mRNA 水平，我們通過(guò) RT-qPCR 檢測(cè)了各組的 mRNA 水平變化。

結(jié)果顯示，模型組心肌組織中 TH 和 ChAT 的 mRNA 水平升高，HGWD 降低了兩者的 mRNA 水平，且高劑量時(shí)下調(diào)效果更明顯。此外，與模型組相比，TRPM7 抑制劑組的 TH 和 ChAT mRNA 水平顯著降低，而 TRPM7-OE 組則顯著升高。此外，HGWD + TRPM7-OE 組的 TH 和 ChAT mRNA 水平顯著低于 TRPM7-OE 組（圖 10A）。

此外，NGF 是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育并維持其活性的蛋白質(zhì)，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是交感神經(jīng)元生存必需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。目前的研究表明，NGF 的表達(dá)水平可能與局部交感神經(jīng)支配密度密切相關(guān)。

我們進(jìn)一步使用 Western Blot 分別檢測(cè)了心肌組織和交感神經(jīng)節(jié)中 TH、ChAT、GAP-43 和 NGF 的分布。HGWD 以劑量依賴性方式降低了 TH、GAP-43 和 ChAT 的表達(dá)水平，同時(shí)增加了 NGF 的表達(dá)水平。TRPM7 抑制劑組的 TH、GAP-43 和 ChAT 表達(dá)水平較低，NGF 表達(dá)水平較高，而 TRPM7-OE 組則相反。經(jīng) HGWD 處理后，HGWD + TRPM7-OE 組的 TH、GAP-43 和 ChAT 表達(dá)水平顯著降低，而 NGF 表達(dá)水平升高（圖 10B–E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HGWD 通過(guò)抑制 TRPM7 對(duì)糖尿病自主神經(jīng)重塑產(chǎn)生抑制作用，并促進(jìn)心臟交感神經(jīng)修復(fù)。

近期研究表明，糖尿病心臟自主神經(jīng)重塑降低了室性心律失常的閾值，可能是惡性心律失常事件發(fā)生率升高的重要機(jī)制。然而，由于心臟交感和副交感神經(jīng)之間的復(fù)雜關(guān)系——它們既協(xié)同又拮抗還相互轉(zhuǎn)化——目前針對(duì)單一神經(jīng)的治療干預(yù)無(wú)法有效解決心臟自主神經(jīng)重塑的問(wèn)題。中醫(yī)的“營(yíng)衛(wèi)學(xué)說(shuō)”涵蓋了機(jī)體內(nèi)部陰陽(yáng)的整體和動(dòng)態(tài)平衡，強(qiáng)調(diào)通過(guò)機(jī)體自身的調(diào)節(jié)和修復(fù)機(jī)制恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。因此，本研究創(chuàng)新性地運(yùn)用這一理論來(lái)理解DCAN的病理生理進(jìn)展?；谶@一理論框架制定的HGWD在臨床實(shí)踐中廣泛用于治療糖尿病神經(jīng)病變，并顯示出獨(dú)特的療效。

我們首先通過(guò)隨機(jī)臨床試驗(yàn)評(píng)估了HGWD治療DCAN的臨床療效。鑒于心率變異性（HRV）的無(wú)創(chuàng)性和客觀性，歐美專家組在20世紀(jì)90年代提出將HRV作為評(píng)估自主神經(jīng)活動(dòng)的最佳定量指標(biāo)。HRV捕捉RR間期之間竇性節(jié)律的細(xì)微變化，是反映心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡的敏感指標(biāo)。在糖尿病神經(jīng)病變的早期階段就會(huì)出現(xiàn)HRV的變化，這使得能夠監(jiān)測(cè)早期糖尿病患者的自主神經(jīng)功能變化，以便早期發(fā)現(xiàn)。在本研究中，我們采用HRV時(shí)域分析來(lái)研究DCAN患者。HRV參數(shù)包括SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50。

SDNN表示患者平均正常RR間期的標(biāo)準(zhǔn)差，而SDANN表示每5分鐘平均正常RR間期的標(biāo)準(zhǔn)差。這兩個(gè)參數(shù)均用于評(píng)估交感神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，其水平降低通常與交感神經(jīng)緊張?jiān)黾酉嚓P(guān)。RMSSD反映相鄰RR間期差值的均方根，而pNN50表示總相鄰RR間期差值>50ms的百分比，兩者均與副交感神經(jīng)活動(dòng)成正比。對(duì)入組患者進(jìn)行HRV分析發(fā)現(xiàn)，SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50指標(biāo)均低于正常值，這表明長(zhǎng)期高血糖損害了心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的功能，表現(xiàn)為交感神經(jīng)活動(dòng)增加和副交感神經(jīng)活動(dòng)受損。經(jīng)過(guò)HGWD治療后，與Betaloc組相比，HRV參數(shù)水平在不同程度上有所提高，這表明HGWD抑制了交感神經(jīng)活動(dòng)，改善了副交感神經(jīng)活動(dòng)，并可能在保護(hù)心臟迷走神經(jīng)的同時(shí)恢復(fù)自主神經(jīng)系統(tǒng)的平衡。

血糖控制不佳是DCAN的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在血糖調(diào)節(jié)初次失衡時(shí)就發(fā)現(xiàn)了心臟自主調(diào)節(jié)受損。長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放增加、氧化應(yīng)激和晚期糖基化終產(chǎn)物形成，從而引發(fā)電解質(zhì)和代謝紊亂，這是心臟自主神經(jīng)調(diào)節(jié)異常的基礎(chǔ)。DCCT（糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(yàn)）研究表明，強(qiáng)化血糖控制使DCAN的患病率降低了50%。經(jīng)過(guò)HGWD治療后，DCAN患者的HbA1c水平顯著下降。HGWD通過(guò)其降糖作用同時(shí)緩解了DCAN。在這方面，建議加強(qiáng)對(duì)T2DM患者血糖水平和HbA1c水平的臨床監(jiān)測(cè)，這有助于減少DCAN的發(fā)生。

此外，糖尿病患者的心臟交感神經(jīng)會(huì)發(fā)生過(guò)度增生，即所謂的神經(jīng)重塑。長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致心臟自主神經(jīng)（包括交感神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)）的重新分布。交感和副交感神經(jīng)在空間分布和功能上的不平衡導(dǎo)致心肌細(xì)胞對(duì)兒茶酚胺和乙酰膽堿的敏感性發(fā)生改變，從而引起心肌細(xì)胞的電生理紊亂。TH、ChAT和GAP-43是心臟自主神經(jīng)重新分布的相關(guān)標(biāo)志物。其中，TH反映心臟中交感神經(jīng)的分布，ChAT是對(duì)迷走神經(jīng)分布和重新分布的標(biāo)志物，而GAP-43是用于標(biāo)記新生心臟中自主神經(jīng)的重要物質(zhì)之一。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，TH、ChAT和GAP-43的水平顯著升高。HGWD干預(yù)減緩了這一進(jìn)程，減少了PES后誘發(fā)室性早搏和室性心動(dòng)過(guò)速等心律失常的可能性。這表明HGWD可以降低糖尿病心律失常的易感性，抑制糖尿病自主神經(jīng)重塑，并促進(jìn)心臟交感神經(jīng)的修復(fù)。

為了更好地理解HGWD治療DCAN的藥理機(jī)制，我們進(jìn)行了UPLC-MS、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和SPR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，HGWD的活性成分可能通過(guò)激活A(yù)MPK通路對(duì)DCAN發(fā)揮治療作用。AMPK作為一種對(duì)葡萄糖高度敏感的受體，是糖尿病和其他代謝性疾病研究的焦點(diǎn)。STZ誘導(dǎo)的糖尿病會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重高血糖，隨后損害神經(jīng)生物能量學(xué)并降低AMPK活性。作為一種AMPK激活劑，二甲雙胍已被證明可以緩解糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)的痛覺過(guò)敏和觸覺過(guò)敏。

在我們的研究中，HGWD治療在糖尿病大鼠中對(duì)AMPK通路產(chǎn)生了與二甲雙胍類似的影響。HGWD治療顯著激活了AMPK通路。此外，HGWD對(duì)AMPK通路的激活影響了糖尿病大鼠中TrkA的表達(dá)。我們觀察到在高糖條件下TrkA活性受到抑制，而AMPK信號(hào)的抑制導(dǎo)致TrkA磷酸化水平顯著下降，同時(shí)神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著上升。然而，HGWD干預(yù)上調(diào)了AMPK/TrkA的表達(dá)水平。

研究表明，在神經(jīng)元中，AMPK在Ser789處磷酸化TrkA信號(hào)適配蛋白IRS。TrkA作為NGF的特異性高親和力受體，介導(dǎo)NGF的大多數(shù)生物功能。值得注意的是，TrkA促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)，其與上游NGF的結(jié)合抑制了炎癥因子的釋放，從而減少炎癥引起的神經(jīng)損傷。NGF在心臟再神經(jīng)支配中起著關(guān)鍵作用，作為參與交感神經(jīng)再生和過(guò)度神經(jīng)支配的化學(xué)趨向因子。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HGWD增加了NGF的表達(dá)水平，并在糖尿病模型中促進(jìn)了心臟交感神經(jīng)的再生。此外，Ieda等指出，糖尿病會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞中NGF表達(dá)下降，從而引發(fā)DCAN。

此外，被NGF激活的TrkA通過(guò)PI3K信號(hào)通路在海馬神經(jīng)元中抑制TRPM7的表達(dá)。研究表明，電針可以通過(guò)TrkA/PI3K途徑調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注后TRPM7的表達(dá)。剛性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接結(jié)果表明，TrkA和TRPM7形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對(duì)接模型。我們發(fā)現(xiàn)，TrkA激活后TRPM7水平下降，這表明TrkA直接影響TRPM7的表達(dá)，無(wú)需通過(guò)其他途徑介導(dǎo)。利用pAAV-TRPM7干擾糖尿病大鼠中TRPM7的表達(dá)，我們的研究表明，TRPM7的激活增加了心律失常的易感性，加劇了心肌纖維化，并提高了心臟自主神經(jīng)重新分布標(biāo)志物的表達(dá)水平。這表明TRPM7可能是抑制自主神經(jīng)重塑的潛在靶點(diǎn)。

研究表明，TRPM7在糖尿病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用，在高糖條件下在免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)。TRPM7是胰腺內(nèi)分泌發(fā)育和高脂飲食誘導(dǎo)的β細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。抑制TRPM7表達(dá)已被證明可以提高葡萄糖刺激的胰島素分泌，以緩解Ⅰ型糖尿病。同時(shí)，通過(guò)基因沉默抑制成年大鼠大腦中的TRPM7通道，結(jié)果導(dǎo)致神經(jīng)元死亡顯著減少，從而表明TRPM7通道可能對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。綜上所述，HGWD通過(guò)激活A(yù)MPK、進(jìn)一步磷酸化TrkA以及促進(jìn)TrkA與NGF的結(jié)合，在預(yù)防和控制DCAN方面發(fā)揮了重要作用，從而抑制了TRPM7通道的表達(dá)。

最后，由于臨床研究樣本量較小、觀察期較短，有必要進(jìn)一步增加樣本量和觀察指標(biāo)，以獲得更客觀的研究結(jié)果。

【結(jié)論】

綜上所述，HGWD通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/TrkA/TRPM7通路，抑制了心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的重塑，降低了室性心律失常的易感性，并改善了DCAN。進(jìn)一步闡明了TRPM7與DCAN之間的新關(guān)聯(lián)，提示TRPM7可能是解決自主神經(jīng)重塑問(wèn)題的潛在靶點(diǎn)。此外，本研究為在慢性病干預(yù)中應(yīng)用傳統(tǒng)中藥方劑HGWD奠定了基礎(chǔ)，突顯了其高度的臨床適用性。

關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟與邏輯鏈

1、臨床療效驗(yàn)證

對(duì)象：194例DCAN患者（HGWD組 vs 美托洛爾組）

指標(biāo)：HRV參數(shù)（SDNN、RMSSD等）、HbA1c、室性早搏次數(shù)

結(jié)論：HGWD顯著改善自主神經(jīng)失衡，效果與美托洛爾相當(dāng)。

2、活性成分鑒定

方法：UPLC-MS定量分析HGWD中7種成分（如芍藥苷46.7851 μg/mL）

3、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘：HGWD成分→276個(gè)潛在靶點(diǎn)，KEGG富集顯示AMPK通路相關(guān)。

分子對(duì)接：芍藥苷、黃芪皂苷IV等與AMPK結(jié)合能≤-5 kcal/mol，提示強(qiáng)結(jié)合。

4、AMPK/TrkA通路驗(yàn)證

動(dòng)物干預(yù)：糖尿病大鼠分組（HGWD組、AMPK激動(dòng)劑組、AMPK抑制劑組）