在疾病確定的情況下，選表型、定基因是課題展開的基礎(chǔ)。 靶基因的獲取是研究的開始 。除了做二代測序、單細胞測序和高通量篩選之外，CRISPR系統(tǒng)也是個不錯的策略。而且，與其他篩選手段相比， CRISPR/Cas9體系性價比更高、特異性更高、與表型關(guān)系更確切 。自從2012年體外編輯以來，CRISPR/Cas9文庫篩選已經(jīng)發(fā)表不少頂刊論文。
2024年12月，Nature雜志發(fā)表題為Central control of dynamic gene circuits governs T cell rest and activation的研究論文。研究團隊首先通過CRISPR篩選技術(shù)針對 T 細胞中IL-2Rα的上游調(diào)控因子，篩選出100多個在不同細胞類型和刺激條件下影響IL-2Rα表達的特異性轉(zhuǎn)錄因子 (Fig1b），其中有16個是共有的調(diào)控因子（12個具有相似的效應），展現(xiàn)出IL-2Rα上游調(diào)控網(wǎng)絡的復雜性。通過CRISPR篩選，揭示表觀調(diào)控基因MED12 是 T 細胞靜息和激活的核心調(diào)控基因，為免疫治療提供借鑒價值。
這項研究使用的慢病毒文庫感染方式是常規(guī)手段，感染效率偏低，同時文庫相對較小（~6000 sgRNA）。2025年3月，Nature雜志發(fā)表題為Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3的研究論文。該研究則是通過全基因組CRISPR篩選技術(shù)，系統(tǒng)性鑒定了調(diào)控人類 T 細胞中FOXP3表達的關(guān)鍵基因，并深入解析RBPJ-NCOR復合物作為FOXP3新型負調(diào)控因子的分子機制。研究不僅揭示FOXP3誘導的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，還為自身免疫疾病的細胞治療提供新靶點。
Fig1展示了在人類原代CD4+ T 細胞中進行全基因組CRISPR篩選流程及關(guān)鍵結(jié)果，目的是系統(tǒng)性鑒定調(diào)控FOXP3表達的基因。圖中包含以下核心部分：篩選流程示意圖，關(guān)鍵基因的CRISPR篩選結(jié)果（火山圖和柱狀圖）和 GO富集分析（底部通路富集）。
1. 篩選流程。步驟包括：① 從健康人外周血分離原代CD4+ T 細胞（Naive狀態(tài)）；② 用慢病毒文庫（含77,491個sgRNA，靶向19,113個基因，每個基因4條sgRNA）感染細胞；③ 通過電穿孔遞送Cas9蛋白（SLICE技術(shù)），實現(xiàn)高效基因敲除；④ iTreg誘導：刺激TCR（抗CD3/CD28抗體）并在TGF-β + IL-2 + 抗壞血酸（Ascorbate）條件下誘導iTreg分化。⑤ 表型分選：72小時后，通過流式細胞術(shù)（FACS）將細胞分為 FOXP3高表達（FOXP3high）和低表達（FOXP3low）兩組（各占15%極端群體）。該研究也是直接使用人類原代 T 細胞進行篩選，結(jié)果更貼近生理狀態(tài)，覆蓋度更高；并采用雙保險設(shè)計慢病毒sgRNA + Cas9電穿孔，確保敲除效率。
2. 篩選結(jié)果（火山圖與柱狀圖）。X軸：sgRNA的log2 Fold Change（FOXP3high vs. FOXP3low），反映基因敲除對FOXP3表達的影響程度。Y軸：False Discovery Rate（FDR），統(tǒng)計顯著性。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：負調(diào)控因子（紅色）：敲除后FOXP3表達升高（如RBPJ、HDAC3、UHRF1）。正調(diào)控因子（藍色）：敲除后FOXP3表達降低（如TGFBR1、SMAD3、FOXP3自身）。
柱狀圖展示特定基因的sgRNA在FOXP3 high 和FOXP3 low 群體中的富集情況。紅色柱：負調(diào)控因子（如RBPJ、HDAC3）的sgRNA在FOXP3 high 群體中富集。藍色柱：正調(diào)控因子（如SMAD3、FOXP3）的sgRNA在FOXP3 low 群體中富集。關(guān)鍵基因舉例：RBPJ是Notch信號通路的核心轉(zhuǎn)錄因子，但本研究揭示其通過非經(jīng)典途徑抑制FOXP3。HDAC3是組蛋白去乙?；福cRBPJ形成復合物抑制FOXP3表達。TGFBR1/SMAD3已知是TGF-β信號通路成員，驗證了篩選的可靠性。
3. 通過GO富集分析將篩選到的調(diào)控因子按功能分類：FOXP3負調(diào)控通路（紅框）：Notch信號如Intracellular NOTCH1 regulates transcription，后續(xù)實驗證明RBPJ作用獨立于Notch。表觀調(diào)控如Histone modification、Ubiquitin E3 ligase等，提示FOXP3受多種表觀機制抑制。T 細胞激活如Regulation of αβ-T cell activation，表明TCR信號可能通過RBPJ抑制FOXP3。FOXP3正調(diào)控通路（藍框）：TGF-β信號如Regulation of TGFβ receptor signaling。染色質(zhì)重塑：如Chromatin organization、Transcription preinitiation complex assembly。代謝調(diào)控：如N-glycan biosynthesis，提示糖基化可能影響FOXP3穩(wěn)定性。
該研究首次在全基因組范圍內(nèi)鑒定FOXP3的調(diào)控網(wǎng)絡，涵蓋已知和未知因子。RBPJ新功能突破其作為Notch通路元件的傳統(tǒng)認知，揭示其通過NCOR-HDAC3復合物直接抑制FOXP3。
從Fig1文庫篩選、到Fig2 單細胞多組學（Perturb-icCITE-seq）驗證，再到Fig3的Loss-of-function濕實驗表型驗證， 形成完整證據(jù)鏈。流程完整，邏輯嚴謹，值得借鑒！
芒果之見：文庫篩選一直是國自然熱點，通過文庫篩選出關(guān)鍵基因并進行深入分析。其他基因篩選思路包括：高通量測序、引藥入疾等。新技術(shù)Perturb-seq讓CRISPR篩選得以在單細胞層面上進行細胞特異性和背景特異性的分析。CRISPR篩選＋空間轉(zhuǎn)錄組也已有論文發(fā)表 () 。一招鮮，吃遍天！這些新技術(shù)是沖擊頂刊的有力工具，有條件的小伙伴可以速速借鑒。
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