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近日，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部劉偉研究員團(tuán)隊(duì)，以深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心為第一完成單位，聯(lián)合南方科技大學(xué)劉忠民教授團(tuán)隊(duì)及華南理工大學(xué)李健潮教授團(tuán)隊(duì)，在

Nature Communications

發(fā)表題為

Structural insights into the dual Ca

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-sensor-mediated activation of the PPEF phosphatase family

的重要研究成果。該研究首次揭示了絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PPEF家族受雙重鈣離子傳感器協(xié)同驅(qū)動(dòng)的激活機(jī)制，為乳腺癌、胃癌等重大疾病的靶向治療提供了新的理論依據(jù)和潛在干預(yù)策略。

作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子，PPEF家族磷酸酶與乳腺癌、胃癌及遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病密切相關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，PPEF1在感覺神經(jīng)元、生殖系統(tǒng)及免疫器官中廣泛分布，不僅是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，還可作為胃癌mRNA疫苗的潛在靶點(diǎn)；PPEF2則通過調(diào)控凋亡信號(hào)激酶參與癌癥進(jìn)程，其錯(cuò)義突變與先天性遺傳疾病密切相關(guān)。然而，與其他磷酸酶家族成員相比，PPEF亞型的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與分子機(jī)制長期未明，極大制約了其生物學(xué)功能解析及疾病干預(yù)策略的開發(fā)。

本研究以PPEF家族的原型成員——果蠅視網(wǎng)膜退化蛋白RDGC為切入點(diǎn)，結(jié)合冷凍電鏡（Cryo-EM）、X射線晶體學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，系統(tǒng)解析了RDGC/鈣調(diào)蛋白（CaM）全酶復(fù)合物在無鈣（自抑制態(tài)，3.6 ?）和鈣結(jié)合（激活態(tài)，2.8 ?）條件下的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

通過冷凍電鏡圖像和X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)，本研究清晰描繪了PPEF磷酸酶從靜息狀態(tài)到催化位點(diǎn)暴露的動(dòng)態(tài)構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程，揭示了PPEF家族雙重鈣傳感器（CaM和EF-like/EF-hand結(jié)構(gòu)域）協(xié)同驅(qū)動(dòng)的“杠桿式”激活機(jī)制：在靜息狀態(tài)下，CaM與EF-like/EF-hand結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，通過延伸IQ基序（extended-IQ motif）形成“分子鎖”，封閉催化位點(diǎn)；鈣離子結(jié)合后，雙重鈣傳感模塊觸發(fā)延伸 IQ基序發(fā)生構(gòu)象翻轉(zhuǎn)，催化中心暴露，從而實(shí)現(xiàn)激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PPEF蛋白磷酸酶受雙重鈣離子傳感器激活的分子機(jī)制在進(jìn)化過程中高度保守，這為在原子層面解析PPEF家族誘發(fā)癌癥、遺傳性疾病的分子病理提供了關(guān)鍵結(jié)構(gòu)框架。

本研究的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：

1.RDGC/CaM全酶復(fù)合物自抑制態(tài)結(jié)構(gòu)解析：在無鈣條件下，研究團(tuán)隊(duì)利用6,822張冷凍電鏡圖像重構(gòu)出分辨率為3.6 ?的RDGC/CaM復(fù)合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，RDGC的延伸IQ基序（aa 1–61）通過N端的經(jīng)典IQ基序（aa 1–25）與CaM結(jié)合，而C端α螺旋（aa 26–61）與EF-like/EF-hand結(jié)構(gòu)域形成疏水互作，共同封閉催化位點(diǎn)（Asp158、His160等）（圖1）。

進(jìn)一步分析表明，關(guān)鍵抑制界面包括CaM結(jié)合界面和EF-like/EF-hand結(jié)合界面。CaM結(jié)合界面上，延伸IQ基序中的Ile12、Trp15、Tyr16嵌入CaM C葉的疏水口袋（Ile86、Phe90等），通過氫鍵（Lys14-Glu48等）穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。EF-like/EF-hand結(jié)合界面上，EF-like結(jié)構(gòu)域的Leu446、Leu476等與延伸IQ基序的Ile33、Leu37等形成疏水互作，EF-hand結(jié)構(gòu)域的Leu557、Leu558等與延伸IQ基序的Phe51、Phe52等緊密堆積。此外，延伸IQ基序的Tyr39通過陽離子-π作用與催化位點(diǎn)Arg333結(jié)合，有效阻斷底物進(jìn)入。

2. RDGC/CaM全酶復(fù)合物激活態(tài)結(jié)構(gòu)解析：在10 mM CaCl2條件下，研究團(tuán)隊(duì)利用815,266個(gè)冷凍電鏡顆粒重建出2.8 ?分辨率的RDGC/CaM激活態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，鈣離子結(jié)合觸發(fā)雙重鈣傳感器的重構(gòu)，導(dǎo)致CaM和EF-like/EF-hand結(jié)構(gòu)域發(fā)生協(xié)同構(gòu)象變化。具體而言，CaM結(jié)合鈣離子后，CaM的N葉與C葉間距縮短，形成更緊湊的構(gòu)象，并將延伸IQ基序N端（Ile6、Ile10）拉入疏水口袋。同時(shí)，EF-hand結(jié)構(gòu)域的Asp539、Glu550等殘基結(jié)合鈣離子后，推動(dòng)延伸IQ基序翻轉(zhuǎn)，從而暴露催化位點(diǎn)，最終形成由兩個(gè)RDGC和兩個(gè)CaM組成的異源四聚體（70 ? × 186 ?），顯著增強(qiáng)磷酸酶催化活性。

3. 關(guān)鍵位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸酶功能的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)開展了一系列突變實(shí)驗(yàn)。CaM結(jié)合缺陷突變：將延伸IQ基序中的Ile12突變?yōu)楣劝彼?，?dǎo)致CaM結(jié)合親和力下降236倍，并顯著降低磷酸酶活性。EF-hand鈣傳感失效：將EF-hand結(jié)構(gòu)域的鈣結(jié)合位點(diǎn)Asp539-Asp541-Glu545-Glu550-Asn581-Asp583-Lys585突變?yōu)楸彼幔耆茐拟}離子結(jié)合，使磷酸酶活性在鈣離子存在時(shí)無顯著提升。延伸IQ基序的杠桿效應(yīng)阻斷：將延伸IQ基序的Cys29-Asn30-Trp31-Gln32突變?yōu)楦拾彼幔钄噔}誘導(dǎo)的構(gòu)象傳遞，導(dǎo)致磷酸酶活性降低。

4. PPEF家族的功能保守性。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，PPEF家族的雙重鈣離子傳感激活機(jī)制在哺乳動(dòng)物中具有高度保守性。結(jié)構(gòu)預(yù)測：哺乳動(dòng)物PPEF1/2與RDGC在延伸IQ基序和EF-like/EF-hand結(jié)構(gòu)域的一級(jí)序列高度保守，AlphaFold預(yù)測的PPEF1/2模型與實(shí)驗(yàn)解析結(jié)構(gòu)高度相似。功能保守性實(shí)驗(yàn)：在小鼠PPEF1中同樣觀察到鈣離子依賴的酶活增強(qiáng)現(xiàn)象，而CaM結(jié)合缺陷（Ile17-Leu21-Val22-Ile23-Trp26-Tyr27突變?yōu)楣劝彼幔┖虴F-hand鈣結(jié)合缺陷（Asp580-Asp582-Leu586-Glu591-Asn622-Asp624-Asn626突變?yōu)楸彼幔┚鶎?dǎo)致磷酸酶活性下降。

圖1 PPEF家族蛋白磷酸酶調(diào)控機(jī)制示意圖

本研究的創(chuàng)新之處在于，首次揭示了PPEF家族磷酸酶通過雙重鈣傳感器協(xié)同作用驅(qū)動(dòng)延伸IQ基序“杠桿式”翻轉(zhuǎn)的激活機(jī)制，為理解絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的動(dòng)態(tài)調(diào)控提供了新視角（圖1）。同時(shí)，通過結(jié)構(gòu)-功能解析鎖定關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，為靶向PPEF介導(dǎo)的疾?。ㄈ缛橄侔⑽赴┘斑z傳性神經(jīng)退行性疾?。┨峁┝藵撛诘木珳?zhǔn)干預(yù)策略。此外，該研究還為其他鈣依賴性磷酸酶的調(diào)控機(jī)制提供了借鑒，為新型藥物開發(fā)和信號(hào)通路研究奠定了基礎(chǔ)。

該論文由劉偉研究員、劉忠民教授和李健潮教授共同擔(dān)任通訊作者。醫(yī)學(xué)中心博士研究生劉佳與南方科技大學(xué)博士研究生吳藏為共同第一作者。醫(yī)學(xué)中心技術(shù)員劉宇揚(yáng)、陳倩茍，碩士研究生丁玉珍，以及上海有機(jī)所潘李鋒教授、林芷喬和醫(yī)學(xué)中心肖康博士均為本研究做出了重要貢獻(xiàn)。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-58261-z

制版人：十一

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（*排名不分先后）