導師
小李，這批衰老組織樣本的 WB 結(jié)果怎么又沒有統(tǒng)計學意義?。窟@結(jié)果靠譜么！
老師，數(shù)據(jù)重復性有點差，而且內(nèi)參蛋白 β-actin 的條帶也總是深淺不一，我也不知道咋辦了。
小李
導師
是不是蛋白濃度沒有拉齊，上樣量不一樣？
拉齊了，蛋白定量試劑我都換新的了，內(nèi)參還是不齊。
小李
我又把上樣量按照 β-actin 重新做了調(diào)整，但是……目的蛋白沒趨勢了！
小李
導師
β-actin 這個內(nèi)參適合衰老組織么？你查查文獻
…… 第二天 ……
BBQ 了，有文獻報道 β-actin 有時候表達會不穩(wěn)，有些期刊還要求對內(nèi)參進行驗證，我該怎么辦？
小李
導師
咱們的樣品還夠做驗證嗎？
樣品只夠再跑一次的，驗證完就不夠做正式實驗了。
小李
導師
做實驗最糟心的就是數(shù)據(jù)趨勢與預期大相徑庭，多次重復試驗，次次結(jié)果不一致，甚至連內(nèi)參都選不明白。甚至搞不好，還要落個學術(shù)不端的帽子！尤其在做衰老組織的 WB 實驗時，這樣的問題總是頻繁出現(xiàn)。為了助力廣大科研人員破解衰老相關(guān)疾病研究中的 WB 難題，我們總結(jié)了以下「痛點」及解決方案：
01
衰老相關(guān)疾病研究中 WB 痛點直擊
1. 目的條帶太難出
（點擊查看原因分析及解決方案）
01
2. 目的蛋白趨勢總不對
（點擊查看原因分析及解決方案）
01
3. 內(nèi)參蛋白不穩(wěn)定
（點擊查看原因分析及解決方案）
01
小小內(nèi)參蛋白竟然對 WB 實驗結(jié)果有這么多影響？甚至很容易被忽略。近年來已有研究發(fā)現(xiàn)，多個經(jīng)典內(nèi)參蛋白在衰老組織中的表達并不穩(wěn)定！
02
哪些內(nèi)參不適合用于衰老組織的 WB 實驗？
2025 年 2 月，來自德州大學達拉斯分校行為與腦科學學院神經(jīng)科學系的一項研究，對胚胎期（E15-P0）和出生后（P0-P20，Adult）小鼠皮質(zhì)樣本中的 GAPDH、β-actin 和 β-tubulin 進行了總蛋白歸一化的 WB 分析[1]。結(jié)果顯示，在出生到成年早期，小鼠皮層中 GAPDH 蛋白水平明顯增加，β-actin 和 β-tubulin 水平降低。
圖源：參考文獻[1]
2020 年 7 月，加拿大的一項研究通過總蛋白歸一化的 WB 分析，比較了 7 月齡和 22 月齡（老年）小鼠神經(jīng)組織中的蛋白質(zhì)豐度[2]。細胞骨架蛋白的分析顯示，老年小鼠 Actin 和 Tubulin 蛋白水平發(fā)生變化。而 Stain-Free 免染總蛋白在不同神經(jīng)組織部位（突觸小泡、粗突觸體、含有突觸小泡的 LP1 上清液、突觸體膜、可溶性突觸體膜、突觸后密度）的表達更為恒定。
圖片來源：參考文獻[2]
上述研究揭示，GAPDH、β-actin 和 β-tubulin 蛋白不適合作為衰老相關(guān)疾病 WB 研究中的內(nèi)參蛋白。為了避免經(jīng)典內(nèi)參蛋白不準確的問題，研究人員已經(jīng)在相關(guān)研究中引入了新的內(nèi)參—Stain-free 總蛋白內(nèi)參！
2024 年 1 月，發(fā)表在 Nature Aging（IF 17.0）上的一項研究發(fā)現(xiàn)，抑制 S6 激酶 （S6K）可降低與年齡相關(guān)的炎癥，并通過內(nèi)溶酶體系統(tǒng)延長壽命[3]。該研究中所有的 WB 分析部分，均采用了 Stain-free 總蛋白內(nèi)參對目標蛋白表達情況進行歸一化分析。
圖片來源：參考文獻[3]
03
Stain-Free 總蛋白內(nèi)參技術(shù)揭秘
Stain-Free 免染成像原理：Stain-Free 免染技術(shù)是一種 Bio-Rad 開發(fā)的用于 Western Blot 實驗中的總蛋白歸一化方法。該技術(shù)使用獨特的三鹵化合物使蛋白質(zhì)具備直接在凝膠中發(fā)熒光的功能，且僅需短時間的紫外光激活步驟，可檢測低至 10～25 ng 的蛋白質(zhì)。可在約 4 小時內(nèi)實現(xiàn)五分鐘封閉、抗體孵育和印跡檢測 — 比傳統(tǒng)方法更快！
總蛋白內(nèi)參歸一化的計算方法：通過測量印跡膜上每個泳道的總蛋白條帶密度及泳道輪廓來確定每個泳道的上樣量，并進行內(nèi)參歸一化計算。每個泳道中所有的條帶密度總和減去總背景來進行背景扣除。
04
為什么要選擇免染總蛋白內(nèi)參
精準定量，科研數(shù)據(jù)更可靠
與管家蛋白相比，免染總蛋白內(nèi)參提供更可靠的上樣內(nèi)參。
圖片來源：參考文獻[4]
線性比較：使用 10～50?μg HeLa 細胞裂解物作為樣品，三種管家蛋白和免染總蛋白的線性差異。左圖中（a）是膜上的免染總蛋白，（b）、（c）、（d）分別為 β-actin、β-tubulin 和 GAPDH 的化學發(fā)光條帶。泳道標簽對應于總蛋白上樣量（μg）。盡管 β-actin 和 β-tubulin 信號呈線性，但光密度比仍遠低于實際加樣的預測「響應值」，而免染信號與預期結(jié)果相一致（e）
與其他總蛋白歸一化方法（如 Ponceau S）相比， Stain-Free 方法在各種條件下都能保持高準確性和精確度。
圖片來源：參考文獻[5]
便捷高效，實驗流程大提速
可在電泳結(jié)束后，代替考馬斯亮藍染色，檢測樣品提取效果。
優(yōu)勢點：免染與考染相比，具有更高的可重復性數(shù)據(jù)和較小的變異系數(shù)?？捡R斯染料與蛋白免疫印跡或質(zhì)譜分析不兼容，免染技術(shù)與大多數(shù)下游實驗兼容。
圖片來源：Bio-Rad 官網(wǎng)
線性動態(tài)范圍：免染技術(shù)用于總蛋白質(zhì)測量。A. HeLa 細胞裂解稀釋液上樣，80～2.5 μg 總蛋白；B. 細胞裂解稀釋液上樣，20～1 μg 總蛋白。
可在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，代替麗春紅 S 染色，檢測蛋白轉(zhuǎn)印效果。
優(yōu)勢點：與麗春紅 S 染色相比，觀察到的條帶強度不取決于染色或脫色的持續(xù)時間，且條帶強度不會隨時間降低，可以在短暫的 2 分鐘內(nèi)驗證蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印效率。
圖片來源：Bio-Rad 官網(wǎng)
評估蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)?。菏褂妹馊境上裣到y(tǒng)評估轉(zhuǎn)印效率。使用 Stain-Free 成像儀拍攝轉(zhuǎn)印前后的凝膠和轉(zhuǎn)印后的膜圖像。將血紅蛋白的 1:2 梯度稀釋液（起始量為 80 ng），與 1.8 μg BSA/泳道一起電泳（上面條帶為 BSA），在 4～20% 的 26 孔 Criterion Stain Free 凝膠上進行電泳分離。
廣泛適用，滿足多元科研需求
免染成像技術(shù)與 Western Blotting 化學發(fā)光/多色熒光檢測完全兼容。能夠輕松應對各種研究領(lǐng)域，包括熱門的腫瘤[6]、神經(jīng)系統(tǒng)[7]等研究方向。
Bio-Rad 公司匠心打造的免染內(nèi)參蛋白，正以卓越的性能和創(chuàng)新的技術(shù)，成為眾多實驗室的不二之選。選擇 Bio-Rad 免染內(nèi)參蛋白，就是選擇更精準、更高效、更廣泛適用的科研伙伴。如您有興趣了解更多關(guān)于Bio-RAD Stain-Free 免染總蛋白內(nèi)參技術(shù)，或希望申請試用，歡迎點擊下方二維碼立即申請。
免費試用
注：
1. 相關(guān)產(chǎn)品僅限科研使用，不作為臨床診斷。
2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區(qū)域的商標。
3. 本活動的最終解釋權(quán)歸伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司。
內(nèi)容策劃：王丹琦
內(nèi)容審核：周育紅
題圖來源：參考文獻[1]
參考文獻
[1] Rodriguez D, Nguyen M, Devata T, Patel D, Tavares-Ferreira D, Nguyen LH. GAPDH, β-actin, and β-tubulin display age-dependent protein expression changes in the mouse cortex during development. Dev Neurosci. 2025 Feb 10:1-17. doi: 10.1159/000544064.
[2] Neris RLS, Dobles AMC, Gomes AV. Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Advantages of Stain-Free Technology. Methods Mol Biol. 2021;2261:443-456. doi: 10.1007/978-1-0716-1186-9_28.
[3] Zhang P, Catterson JH, Gr?nke S, Partridge L. Inhibition of S6K lowers age-related inflammation and increases lifespan through the endolysosomal system. Nat Aging. 2024 Apr;4(4):491-509. doi: 10.1038/s43587-024-00578-3. Epub 2024 Feb 27.
[4] Taylor SC, Posch A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Res Int. 2014;2014:361590. doi:10.1155/2014/361590
[5] Maloy A, Alexander S, Andreas A, Nyunoya T, Chandra D. Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data. Anal Biochem. 2022;654:114840. doi:10.1016/j.ab.2022.114840
[6] Hu X, Du S, Yu J, et al. Common housekeeping proteins are upregulated in colorectal adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma, making the total protein a better "housekeeper". Oncotarget. 2016;7(41):66679-66688. doi:10.18632/oncotarget.11439
[7] Lanzillotta C, Baniowska MR, Prestia F, et al. Shaping down syndrome brain cognitive and molecular changes due to aging using adult animals from the Ts66Yah murine model. Neurobiol Dis. 2024 May 4;196:106523. doi: 10.1016/j.nbd.2024.106523.
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