在真核生物基因組中，開放染色質(zhì)通常富含啟動子、增強(qiáng)子等DNA順式調(diào)控元件 (Core et al., 2014; Heintzman et al., 2009)，對基因轉(zhuǎn)錄 (Adelman and Lis, 2012)、DNA復(fù)制(MacAlpine and Almouzni, 2013)、重組修復(fù) (Clouaire and Legube, 2019; Hauer and Gasser, 2017; Lamm et al., 2021)及應(yīng)激響應(yīng) (Zhu et al., 2013)等一系列生物學(xué)過程具有重要的調(diào)控功能。特別是近年來，關(guān)鍵功能元件的基因編輯有利于農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀的協(xié)同改良 (Rodríguez-Leal et al., 2017; Song et al., 2022; Wang et al., 2022; Yao et al., 2024; Zhou et al., 2023)。目前，已報(bào)道有多種方法如DNase-seq (Boyle et al., 2008; Zhang et al., 2012a; Zhang et al., 2012b)、ATAC-seq (Buenrostro et al., 2013; Lu et al., 2017)、MNase-based MH-seq (Zhang et al., 2023; Zhao et al., 2020)及NOMe-seq (Rhie et al., 2018)等可用于繪制全基因組開放染色質(zhì)的圖譜，但每種方法均不能提供一個(gè)基因組近飽和的開放染色質(zhì)位點(diǎn)（OCSs），且部分OCSs具有方法的特異性 (Nordstr?m et al., 2019; Song et al., 2011; Zhao et al., 2020)。因此，與現(xiàn)有方法具有互補(bǔ)性的新方法的建立將有助于挖掘基因組中一些方法特異性的OCSs及其功能解析，進(jìn)而豐富調(diào)控染色質(zhì)組學(xué)的研究。
近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張文利教授課題組在Plant Biotechnology Journal在線發(fā)表了題為“ISDH-seq: a robust methodology for profiling and characterization of open chromatin”的研究論文。該研究提供了一種鑒定開放染色質(zhì)位點(diǎn)的新方法，簡稱為原位DNase I超敏測序技術(shù)（ISDH），繪制了全基因組開放染色質(zhì)并初步解析了該方法特異的位點(diǎn)的表觀特征及其生物學(xué)功能。
ISDH-seq可用于鑒定不同細(xì)胞數(shù)量樣品的OCSs，最低可用于5萬個(gè)細(xì)胞核規(guī)模的樣品。在一定條件下，該方法通過優(yōu)先切割并原位標(biāo)記生物素偶聯(lián)的dATP和dCTP，通過捕獲生物素標(biāo)記的開放染色質(zhì)區(qū)DNA，結(jié)合測序分析鑒定基因組中OCSs的一種策略。與DNase-seq和ATAC-seq相比，在同一批次的樣品中，該方法可鑒定較多的OCSs，該方法特異性的OCSs具有獨(dú)特的表觀遺傳特征：低DNA甲基化水平、富集H3K27me3抑制性組蛋白標(biāo)記以及與三維染色質(zhì)互作位點(diǎn)具有較高的關(guān)聯(lián)度。
在水稻基因組中，ISDH-seq、DNase-seq和ATAC-seq分別鑒定了62,750, 36,474和28,498個(gè)OCSs，其中21,877個(gè)為共有OCSs，而ISDH特異的OCSs（27,296個(gè)）數(shù)量最多。亞基因組的分布結(jié)果顯示，ISDH-seq的 OCSs更多的富集在3’UTR區(qū)域，而DNase-seq的OCSs在5’UTR和基因下游富集程度更高。綜上所述，ISDH-seq可用于進(jìn)一步豐富水稻基因組的調(diào)控染色質(zhì)景觀。
圖1. 三種不同開放染色質(zhì)方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集的比較分析
真核生物基因組中，OCSs是基因表達(dá)調(diào)控的核心因素之一。分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近，多種方法共有的及ISDH特異性的OCSs與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)性，而在基因體內(nèi)，OCSs與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性，并且ISDH特異的OCSs關(guān)聯(lián)的基因更傾向于組織以及脅迫特異性表達(dá)。
圖2. 不同亞類的OCSs與基因表達(dá)的關(guān)系分析
結(jié)合表觀多組學(xué)數(shù)據(jù)，較系統(tǒng)地解析了不同亞類的OCSs的表觀特征。結(jié)果顯示，ISDH特異的OCSs具較低的CHG甲基化水平和最低的CHH甲基化水平。組蛋白修飾聚類分析結(jié)果顯示，部分ISDH特異的OCSs顯著富集了H3K27me3（聚類簇2），與其關(guān)聯(lián)的基因的表達(dá)水平最低，暗示了這部分OCSs與抑制性表觀標(biāo)記（如H3K27me3）一起協(xié)同調(diào)控基因的表達(dá)。
圖3. 不同亞類的OCSs的表觀遺傳學(xué)特征分析
進(jìn)一步研究結(jié)果表明，富含H3K27me3的ISDH特異的OCSs關(guān)聯(lián)的基因更傾向于組織以及脅迫特異性表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控內(nèi)源刺激以及脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)。其中，在鹽脅迫相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中，在鹽脅迫下，基因LOC_Os09g23620的啟動子區(qū)的染色質(zhì)開放性增強(qiáng)，通過納米瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該OCS具有增強(qiáng)子功能。上述結(jié)果表明，H3K27me3與OCSs一起共同調(diào)控植物對脅迫的響應(yīng)。
圖4. H3K27me3寫富集的ISDH特異的OCSs的功能表征
此外，除直接調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)外，OCSs還能夠通過染色質(zhì)環(huán)間接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，ISDH特異的OCSs參與遠(yuǎn)程調(diào)控的頻率最高，且調(diào)控基因的數(shù)量更多，并且受到多個(gè)反式OCSs共同調(diào)控的ISDH特異的OCSs關(guān)聯(lián)的基因表現(xiàn)出更高的進(jìn)化保守性。因此，在反式調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和馴化方面，不同亞類的OCSs存在功能差異。
圖5. 不同亞類的OCSs的反式調(diào)控作用分析
綜上所述，該研究開發(fā)了ISDH-seq用于繪制作物調(diào)控染色質(zhì)的圖譜，它與現(xiàn)有方法存在較強(qiáng)的互補(bǔ)性。多種方法選擇性應(yīng)用，有助豐富作物調(diào)控染色質(zhì)組學(xué)的研究，有助于挖掘方法特異的OCSs功能位點(diǎn)，解析其生物學(xué)功能并為作物育種利用提供潛在的候選位點(diǎn)。
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生李兆國、閏永行以及已畢業(yè)碩士生楊瀅為論文共同第一作者，張文利教授為論文通訊作者。俄羅斯科學(xué)院西伯利亞分院（SB RAS）Gennadii Borovskii博士等也參與了該項(xiàng)研究。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金和江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。同時(shí)感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物信息學(xué)研究中心為本研究提供的支持。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70069
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