鹽單胞菌（Halomonas sp.）是一類能夠適應(yīng)高鹽高堿環(huán)境生長的極端微生物，因此可以在開放、無滅菌的條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。過去十余年，清華大學(xué)陳國強(qiáng)教授團(tuán)隊以 Halomonas TD01 為底盤，開啟了以聚羥基脂肪酸酯（PHAs）為關(guān)鍵產(chǎn)物的合成生物學(xué)研究。
近日，華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院葉健文團(tuán)隊繼續(xù)基于 Halomonas TD01 底盤，開發(fā)了以群體感應(yīng)系統(tǒng)為核心組件的多功能基因表達(dá)動態(tài)調(diào)控工具，協(xié)同底物碳代謝改造與合成途徑表達(dá)調(diào)諧，實現(xiàn)了超氧歧化酶（SOD）、氨基酸衍生物（靛藍(lán)和紫色桿菌素）等高值產(chǎn)物的合成調(diào)控及產(chǎn)量提升，相關(guān)研究成果以“Developing quorum sensing-based collaborative dynamic control system in Halomonas TD01”和“Metabolic engineering of Halomonas for effective production of tryptophan-derived compounds”為題分別發(fā)表于《Advanced Science》和《Chemical Engineering Journal》期刊。
首先，研究團(tuán)隊對正交的兩套群體感應(yīng)系統(tǒng)（CinR-CinI 與 LuxR-LuxI）進(jìn)行拆解和交叉重組（CinR-LuxI 與 LuxR-CinI），分別構(gòu)建于 A 菌和 B 菌兩種重組菌中，并結(jié)合鹽單胞菌開放發(fā)酵的獨特優(yōu)勢，開發(fā)以 A/B 菌定時混培為誘導(dǎo)條件的基因表達(dá)動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅具有零誘導(dǎo)劑添加、低泄露、輸出強(qiáng)度可調(diào)等優(yōu)勢，而且還可適用于不同規(guī)模的高密度發(fā)酵生產(chǎn)過程（Lin et al., Adv. Sci., 2025）。
同時，研究團(tuán)隊基于該系統(tǒng)，通過級聯(lián) CRISPR/dCas9、類 T7 RNA 聚合酶等基因表達(dá)調(diào)控模塊，完成了基因表達(dá)動態(tài)抑制（超 80% 抑制效率）和信號放大（30-40 倍放大）等多功能調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建及表征測試。
以上調(diào)控系統(tǒng)的成功構(gòu)建，不僅可以實現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)（minCD）、細(xì)胞氧攝取能力（vgb）等分時/定量的表達(dá)調(diào)控，而且還可實現(xiàn)細(xì)胞生長與靛藍(lán)、SOD 蛋白等產(chǎn)物合成的有效解耦連，進(jìn)而提升產(chǎn)量超 100%。在 7L 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵體系下，SOD 產(chǎn)量達(dá)到 4.7 g/L。
與此同時，研究還通過引入 vioABCDE（C. violaceim 來源）基因簇，與 tnaA（E. coli MG1655 來源）、fmo（M. aminisulfidivorans 來源）基因，分別實現(xiàn)以色氨酸為前體分子的高值氨基酸衍生物合成（紫色桿菌素和靛藍(lán)），并圍繞基因表達(dá)調(diào)諧、限速酶挖掘與優(yōu)化、輔因子平衡、中心碳代謝改造等方法，進(jìn)一步提高重組鹽單胞菌的產(chǎn)物合成能力（Liu et al., Chem. Eng. J., 2025）。
研究發(fā)現(xiàn)在鹽單胞菌中，使用葡萄糖酸鈉作為碳源能夠促進(jìn) NADPH 合成，強(qiáng)化輔因子供應(yīng)以滿足色氨酸衍生物合成途徑中附加的 NADPH 消耗。基于關(guān)鍵合成途徑表達(dá)優(yōu)化的條件下，當(dāng)使用 36 g/L 葡萄糖酸鈉作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵時，紫色桿菌素和靛藍(lán)產(chǎn)量可分別提升至 2.57 g/L 和 290.5 mg/L。最終，改造后的工程鹽單胞菌在 7L 發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料培養(yǎng)過程中，靛藍(lán)和紫色桿菌素的產(chǎn)量分別達(dá)到了 1.85 g/L 和 4.79 g/L，產(chǎn)率分別為 51 mg/L/h 和 0.171 g/L/h。
此外，與定時混培動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)不同的是，該研究相繼開發(fā)了基于群體感應(yīng) LuxR-LuxI 的自誘導(dǎo)動態(tài)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，并在 7L 發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料發(fā)酵中實現(xiàn)紫色桿菌素和靛藍(lán)關(guān)鍵合成途徑的自誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控，產(chǎn)量分別達(dá)到 2.64 g/L 和 1.30 g/L。該研究進(jìn)一步討論表示，盡管已開發(fā)的自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)展現(xiàn)出較好的自誘導(dǎo)調(diào)控能力，但在發(fā)酵放大生產(chǎn)的種子擴(kuò)培階段，目的基因仍存在較大的前置泄露表達(dá)風(fēng)險，與前期開發(fā)的定時混培調(diào)控系統(tǒng)相比，很可能會導(dǎo)致發(fā)酵放大的失敗。
總體而言，上述研究不僅為鹽單胞菌合成生物學(xué)的使能技術(shù)開發(fā)提供了有效且巧妙的工具方法，而且還進(jìn)一步拓展了鹽單胞菌底盤的生物合成能力，闡明了鹽單胞菌在重組蛋白、氨基酸衍生物等產(chǎn)物合成的重要潛力，以及更廣譜的生物制造產(chǎn)業(yè)價值。
1. https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202408083
2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894725034424
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