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【寫在前面】：本期推薦的是由浙江工業(yè)大學(xué)、浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院等研究團(tuán)隊(duì)近期發(fā)表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示改良型黃風(fēng)湯通過激活自噬和調(diào)節(jié)腸道菌群緩解糖尿病腎病。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Modified huangfeng decoction alleviates diabetic nephropathy by activating autophagy and regulating the gut microbiota

背景：糖尿病腎病（DN）是糖尿病患者中死亡率最高的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致腎衰竭。改良型黃風(fēng)湯（MHD）在腎臟疾病的臨床治療中被廣泛應(yīng)用。然而，MHD對(duì)DN的具體作用機(jī)制尚未完全闡明。

目的：探討MHD對(duì)小鼠DN的影響及其潛在機(jī)制。

方法：通過液相色譜?質(zhì)譜分析確定MHD的主要成分。構(gòu)建高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN小鼠模型，并用MHD治療6周。檢測血清和尿液參數(shù)，對(duì)組織切片進(jìn)行組織學(xué)染色。通過qPCR和Western blotting檢測代謝、炎癥、纖維化和自噬相關(guān)標(biāo)志物的mRNA和蛋白水平。通過全長16S rRNA測序和非靶向代謝組學(xué)分析盲腸內(nèi)容物的微生物組成和代謝物。

結(jié)果：MHD改善了DN小鼠的胰島素抵抗，并改善了肝臟和脂肪組織中脂質(zhì)代謝和炎癥的變化。此外，MHD降低了血清和尿液中腎損傷標(biāo)志物的水平，并減輕了腎臟的炎癥和纖維化。這些結(jié)果伴隨著腸道屏障功能的增強(qiáng)以及腸道菌群組成和代謝物的顯著改變，表現(xiàn)為有益菌種和代謝物的豐度增加。此外，MHD本身及微生物代謝物精脒通過激活PI3K/AKT/mTOR通路減輕了足細(xì)胞損傷。

結(jié)論：MHD可能通過激活足細(xì)胞自噬（PI3K/AKT/mTOR通路）以及調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝物來改善DN。我們的研究為MHD的作用機(jī)制提供了更全面的理解，并揭示了腸道?腎臟相互作用在DN進(jìn)展中的作用，為其在DN治療中的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

（PS：不想看長篇大論的可以直接拉到文章最后看全文思路總結(jié)）

（圖文摘要）

【前言】

2型糖尿?。═2D）主要由胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞功能的逐漸惡化定義。其患病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升，2021年全球約有5.37億成年人患有T2D。預(yù)計(jì)到2045年，這一數(shù)字將顯著增加，達(dá)到約7.83億。這不僅凸顯了T2D對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成的日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，也強(qiáng)調(diào)了加強(qiáng)預(yù)防和治療策略的緊迫性。然而，糖尿病腎?。―N）的分子機(jī)制尚未完全闡明，這阻礙了有效分子干預(yù)靶點(diǎn)的識(shí)別和開發(fā)。目前，主流治療主要集中在控制血壓、血糖和血脂水平。自20世紀(jì)90年代初以來，血管緊張素阻滯劑（如ACEI和ARB）在DN的管理中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。近年來，新型療法（如SGLT2抑制劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑、GLP-1受體激動(dòng)劑和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑）提供了額外的治療選擇。然而，部分患者仍不可避免地進(jìn)展為終末期腎病，這突顯了對(duì)新療法的迫切需求。

中醫(yī)藥（TCM）基于其整體理論框架，通過其生物活性成分的協(xié)同作用，在DN的治療中表現(xiàn)出多層次的療效。在植物化學(xué)水平上，單味中藥具有特定的生物活性。例如，山藥通過健脾補(bǔ)腎改善DN。此外，黃芪通過其多種植物成分調(diào)節(jié)糖脂代謝，并降低空腹高血糖、蛋白尿和腎小球高濾過等病理標(biāo)志物水平。這些單味中藥的療效在復(fù)方制劑中可能通過成分的協(xié)同作用而增強(qiáng)。黃連解毒湯就是一個(gè)例子，它結(jié)合了四種功能不同的中藥：黃連（降血脂）、黃芩（調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)）、梔子（抗炎）和黃柏（解毒），并通過激活A(yù)GE/RAGE/AKT/Nrf2通路改善DN。同樣，當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪和當(dāng)歸組成，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和降血糖作用，這兩種藥材協(xié)同作用增強(qiáng)了對(duì)DN的治療效果。這種從單味中藥到優(yōu)化復(fù)方制劑的層次化治療策略，突出了系統(tǒng)闡明中醫(yī)藥多組分網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的關(guān)鍵需求，尤其是在草藥處方的臨床多樣性背景下。

改良型黃風(fēng)湯（MHD）由黃芪、僵蠶、蟬蛻、當(dāng)歸和防風(fēng)組成，是一種用于健脾補(bǔ)腎的中藥復(fù)方。黃芪作為主要成分，具有補(bǔ)氣升陽的作用。從黃芪中已鑒定出100多種化合物。黃芪及其活性成分能有效降低DN小鼠的空腹血糖和蛋白尿水平，逆轉(zhuǎn)腎小球高濾過狀態(tài)，并減輕早期DN小鼠模型的病理變化。僵蠶、蟬蛻和當(dāng)歸作為輔助藥材，與黃芪協(xié)同作用以增強(qiáng)其主要療效。防風(fēng)可幫助驅(qū)除風(fēng)邪。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，風(fēng)邪是指導(dǎo)致身體失衡或疾病的外部因素。防風(fēng)的主要活性成分包括香豆素、色原酮和多糖。其中，色原酮、prim-o-glucosylcimifugin和5-O-甲基維薩米奧苷具有顯著的藥理活性，包括有效的鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，被用作藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

在傳統(tǒng)中醫(yī)醫(yī)院的臨床實(shí)踐中，MHD在治療多種原發(fā)性和繼發(fā)性腎臟疾?。òǖ鞍啄颉gA腎病和DN）方面表現(xiàn)出顯著的療效。然而，MHD對(duì)DN的具體作用機(jī)制仍不清楚。新興證據(jù)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞自噬在維持足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，這一過程由PI3K/AKT/mTOR信號(hào)軸嚴(yán)格調(diào)控。在生理?xiàng)l件下，mTOR復(fù)合體1（mTORC1）通過磷酸化ULK1抑制自噬起始，而AKT介導(dǎo)的Bcl-2磷酸化則抑制Beclin-1依賴的自噬體形成。值得注意的是，持續(xù)的PI3K/AKT信號(hào)通過IRS-1的負(fù)反饋加劇胰島素抵抗，而mTOR的過度激活則破壞足細(xì)胞自噬流，導(dǎo)致受損細(xì)胞器的積累和隨后的腎小球?yàn)V過屏障功能障礙。因此，該通路的過度激活與DN的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，使其成為恢復(fù)足細(xì)胞自噬的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

本研究探討了MHD對(duì)高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN小鼠模型的治療效果，并通過全長16S rRNA測序和代謝組學(xué)分析闡明了MHD通過腸道菌群及其代謝物發(fā)揮作用的機(jī)制。此外，還通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了MHD及其微生物代謝物對(duì)足細(xì)胞自噬的影響及其機(jī)制。

【結(jié)果】

1、MHD活性成分的植物化學(xué)分析

通過液相色譜?質(zhì)譜（LC?MS）分析了MHD的成分，并通過與Waters傳統(tǒng)藥物庫2.0比對(duì)，共鑒定出352種成分（見補(bǔ)充材料表S3和S4）。此外，在正負(fù)離子模式下，基于準(zhǔn)確測定分子量、分析質(zhì)譜碎片路徑以及與已知對(duì)照品的保留時(shí)間比對(duì)，在LC?MS光譜中確定了10種主要活性成分（圖1A?B）。鑒定結(jié)果顯示，MHD的活性成分包括二氫香豆素、升麻苷、5-o-methylvisamminol、formononetin、毛蕊異黃酮、黃耆苷II、亞麻酸乙酯、sec-o-glucosylhamaudol和黃酮（圖1C）。

2、MHD降低血糖水平并改善糖尿病小鼠的胰島素敏感性

小鼠分組如圖2A所示。從第二周開始，高脂飲食（HFD）小鼠的體重顯著增加，隨后在鏈脲佐菌素（STZ）注射后體重下降至低于對(duì)照小鼠的水平（圖2B）。此外，經(jīng)過高劑量MHD（H-MHD）治療后，H-MHD治療組小鼠的體重顯著低于糖尿病腎?。―N）治療組小鼠（p < 0.05），然后緩慢增加，而低劑量MHD（L-MHD）、MHD-D、達(dá)格列凈（DSR）和達(dá)格列凈（DAPA）單獨(dú)使用則對(duì)體重?zé)o影響（圖2B）。經(jīng)過6周的H-MHD治療后，DN小鼠的空腹血糖水平顯著降低（p < 0.05）（圖2C）。劑量為1 mg/kg的DAPA對(duì)血糖水平無影響（圖2C）。H-MHD（p < 0.01）、MHD-D（p < 0.05）或DAPA（p < 0.05）治療的DN小鼠血清胰島素水平顯著降低（圖2D）。此外，H-MHD和DAPA通過胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估（HOMA-IR）指數(shù)評(píng)估，顯著緩解了糖尿病誘導(dǎo)的胰島素抵抗（所有p < 0.05）（圖2E）。Western blot分析顯示，H-MHD（p < 0.05）和MHD-D（p < 0.05）治療增加了DN小鼠肝臟和附睪白色脂肪組織（eWAT）中磷酸化胰島素受體β（IRβ）和AKT的水平（圖2F-G）。H-MHD組在增加胰島素信號(hào)傳導(dǎo)方面的總體效果比MHD-D組更為顯著，而單獨(dú)使用DSR對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的影響較小（圖2F-G）。

3、MHD改善糖尿病小鼠的代謝紊亂

與對(duì)照小鼠相比，DN小鼠的肝臟重量顯著增加，而H-MHD治療顯著逆轉(zhuǎn)了這一變化（p < 0.05）（圖3A）。DN小鼠的血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平顯著升高（p < 0.01），經(jīng)MHD治療后降低（p < 0.05）（圖3B）。此外，MHD還緩解了與DN相關(guān)的高脂血癥，表現(xiàn)為血清甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平升高（所有p < 0.05）（圖3C）。MHD-D治療導(dǎo)致血清ALT和TG水平降低（p < 0.05），而單獨(dú)使用DSR和DAPA則對(duì)這些血清參數(shù)無影響（圖3B-C）。組織學(xué)分析顯示，DN小鼠的肝臟呈現(xiàn)增加的脂滴沉積和附睪脂肪細(xì)胞的肥大，而MHD、MHD-D和DAPA有效緩解了脂滴沉積和附睪脂肪細(xì)胞的肥大（圖3D）。相比之下，L-MHD和DSR的效果不明顯（圖3D）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，H-MHD給藥后，DN小鼠肝臟和eWAT中脂生成基因（如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Srebp-1c）和乙酰輔酶A羧化酶（Acc））的相對(duì)mRNA表達(dá)水平顯著降低（所有p < 0.05）（圖3E-F）。相比之下，MHD和MHD-D治療增加了與脂解和脂肪酸氧化相關(guān)的標(biāo)記物（包括激素敏感性脂肪酶（Hsl）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α（Cpt-1α）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（Pparα））的相對(duì)mRNA表達(dá)水平（所有p < 0.05）（圖3E-F）。MHD-D和DAPA也對(duì)這些脂代謝相關(guān)基因在肝臟和eWAT中的表達(dá)調(diào)控有輕微影響（圖3E-F）。

4、MHD改善糖尿病小鼠的腎損傷

隨后，我們?nèi)嫜芯苛薓HD對(duì)DN小鼠腎臟的保護(hù)作用。H-MHD治療有效緩解了DN小鼠血清肌酐（SCR）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（UCR）和尿白蛋白異常升高的水平（p < 0.05），而MHD-D和DAPA治療則適度改善了這些指標(biāo)（圖4A）。組織學(xué)分析清楚地顯示，DN小鼠的腎臟表現(xiàn)出嚴(yán)重的腎損傷和間質(zhì)纖維化，這些變化通過給予H-MHD、MHD-D或DAPA顯著緩解（所有p < 0.01）（圖4B）。相比之下，L-MHD和DSR未能顯著減輕腎損傷（圖4B）。此外，H-MHD、MHD-D和DAPA（所有p < 0.05）強(qiáng)烈抑制了DN小鼠促炎因子和纖維化相關(guān)基因的相對(duì)mRNA表達(dá)（圖4C-D）。這些結(jié)果與DN小鼠腎臟中炎癥通路和纖維化信號(hào)的減弱密切相關(guān)，這通過p65 NF-κB和p38 MAPK的磷酸化水平以及波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）蛋白的水平得到證實(shí)（圖4E）。

5、MHD保護(hù)腸道屏障功能并減輕糖尿病小鼠的結(jié)腸炎癥

接下來，我們研究了MHD對(duì)腸道屏障功能的影響。我們之前的研究已經(jīng)明確了DAPA對(duì)腸道屏障功能和腸道菌群的影響。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注MHD的影響。DN小鼠的結(jié)腸長度比對(duì)照小鼠短，而H-MHD和MHD-D治療恢復(fù)了這一長度（所有p < 0.01）（圖5A）。此外，H-MHD減輕了DN小鼠結(jié)腸組織中的炎性細(xì)胞浸潤并增加了粘液分泌（圖5B）。與組織學(xué)結(jié)果一致，H-MHD和MHD-D上調(diào)了結(jié)腸中緊密連接相關(guān)標(biāo)記物（即claudin-1、occludin和zonula occludens-1（Zo-1））的mRNA和蛋白水平（所有p < 0.05）（圖5C、E）。另一方面，結(jié)腸中炎性細(xì)胞因子和趨化因子（如TNF-α和MCP-1）的mRNA表達(dá)被下調(diào)，而抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)被H-MHD和MHD-D上調(diào)（所有p < 0.05）（圖5D）。相應(yīng)地，H-MHD和MHD-D治療減輕了結(jié)腸中的炎癥通路，表現(xiàn)為p38 MAPK和p65 NF-κB的磷酸化（所有p < 0.05）（圖5E）。單獨(dú)給予L-MHD或DSR對(duì)腸道屏障功能和結(jié)腸炎癥無影響（圖5）。

6、MHD改變糖尿病小鼠腸道菌群的組成和功能

為了探討腸道菌群在MHD改善DN小鼠中的潛在作用，我們對(duì)盲腸菌群進(jìn)行了16S rRNA分析。α多樣性分析顯示，DN小鼠的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著低于H-MHD治療小鼠（p < 0.05）（圖6A）。主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，對(duì)照組、DN組和不同藥物治療組之間的β多樣性存在明顯差異，H-MHD治療組的空間位置接近對(duì)照組（圖6B）。在門水平上，與對(duì)照組相比，DN小鼠中厚壁菌門（Firmicutes）的豐度增加，而疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria）的豐度降低；然而，這些失衡在MHD治療后得到緩解（圖6C）。隨后基于相對(duì)豐度鑒定了前50種細(xì)菌，并以熱圖形式展示（圖6D）。H-MHD增加了有益菌（如Akkermansia muciniphila、Desulfovibrio sp011039085和Clostridium cuniculi）的相對(duì)豐度，同時(shí)減少了有害菌（如Jeotgalibaca ciconiae）的相對(duì)豐度（所有p < 0.05）（圖6D-E）。相比之下，MHD-D和DSR未引起顯著影響（圖6D-E）。此外，相關(guān)性分析顯示，這四種細(xì)菌與腎損傷標(biāo)志物之間存在強(qiáng)相關(guān)性（圖6F）。

7、MHD通過調(diào)節(jié)腸道菌群代謝物改善糖尿病腎病

為了進(jìn)一步鑒定可能負(fù)責(zé)MHD效果的潛在微生物代謝物，我們進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。火山圖顯示，與對(duì)照組相比，DN組中有168種代謝物顯著增加，293種代謝物顯著減少（圖7A）。H-MHD、MHD-D或DSR治療分別導(dǎo)致69、81和84種代謝物水平增加，以及44、53和78種代謝物水平減少（圖7A）。DN和H-MHD治療共同影響的代謝物的維恩圖進(jìn)一步顯示了57種代謝物（圖7B）。這些共同代謝物的KEGG通路分析突出了三大主要通路，即谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及β-丙氨酸代謝（圖7C）。對(duì)這些通路中的代謝物分析顯示，DN小鼠中精脒、亞精胺、L-谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的水平顯著降低（所有p < 0.01），而H-MHD治療后這些代謝物的水平顯著增加（所有p < 0.01）（圖7D）。這些代謝物與前50種細(xì)菌的相關(guān)性分析顯示，精脒和亞精胺與Akkermansia muciniphila、Salmonella enterica、Clostridium cuniculi、Extibacter sp001185345、Desulfovibrio sp011039085和Corynebacterium stationis呈顯著正相關(guān)，而與Jeotgalibaca ciconiae呈顯著負(fù)相關(guān)（圖7E）。此外，精脒與腎損傷標(biāo)志物的相關(guān)性比亞精胺更強(qiáng)（圖7F）。

8、MHD通過激活自噬改善糖尿病小鼠的腎小球損傷

為了進(jìn)一步明確MHD保護(hù)腎功能的機(jī)制，我們對(duì)糖尿病腎病（DN）小鼠腎臟中的足細(xì)胞標(biāo)記物Wilms’腫瘤1（WT-1）進(jìn)行了qPCR和Western blot分析。DN小鼠腎臟中WT-1的mRNA和蛋白水平顯著降低，而高劑量MHD（H-MHD）和MHD-D顯著增加了WT-1的表達(dá)（所有p < 0.05），低劑量MHD（L-MHD）和達(dá)格列凈（DSR）則無此效果（圖8A-B）。腎臟切片的免疫熒光染色顯示，DN組足細(xì)胞丟失明顯，而MHD或MHD-D治療（所有p < 0.001）減輕了腎小球損傷（圖8C）。鑒于足細(xì)胞自噬在糖尿病腎臟病變中的作用，我們?cè)u(píng)估了自噬信號(hào)。DN小鼠腎臟中自噬相關(guān)基因（如Lc3b和Beclin1）的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（p < 0.05），而H-MHD和MHD-D顯著上調(diào)了這些基因的表達(dá)（所有p < 0.05）（圖8D）。自噬底物p62則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（圖8D）。這些結(jié)果進(jìn)一步通過LC3B和p62的蛋白水平得到驗(yàn)證（圖8E）。同樣，L-MHD和DSR對(duì)自噬信號(hào)無顯著影響（圖8D-E）。

9、MHD和微生物代謝物精脒減輕高糖誘導(dǎo)的MPC5足細(xì)胞損傷

為了進(jìn)一步探討MHD和微生物代謝物精脒在足細(xì)胞損傷中的作用，我們采用了高糖（HG）誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷體外模型。通過MTT實(shí)驗(yàn)確定了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中MHD、MHD-D和DSR的使用濃度（圖S1）。與體內(nèi)研究結(jié)果一致，HG誘導(dǎo)的WT-1表達(dá)下調(diào)通過qPCR、Western blot和免疫熒光染色評(píng)估，顯著被MHD和MHD-D逆轉(zhuǎn)（所有p < 0.05）（圖9A-C）。精脒處理對(duì)WT-1水平的影響（圖9A-C）。此外，MHD（p < 0.01）、MHD-D（p < 0.05）和精脒（p < 0.05）通過下調(diào)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)以及減少p38 MAPK和p65 NF-κB的磷酸化，減輕了細(xì)胞炎癥（圖9D-E）。單獨(dú)使用DSR對(duì)足細(xì)胞損傷無顯著影響（圖9）。

10、MHD和精脒通過PI3K/AKT/mTOR通路增加足細(xì)胞自噬

HG處理導(dǎo)致MPC5細(xì)胞中自噬通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平顯著下降，這些變化被MHD、MHD-D和精脒逆轉(zhuǎn)（所有p < 0.05）（圖10A-B）。此外，雙重免疫熒光染色顯示，經(jīng)MHD、MHD-D和精脒處理后，足細(xì)胞中LC3和溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1）的表達(dá)增加（所有p < 0.001）（圖10C）。

11、MHD和MHD-D減輕了DN或HG誘導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR通路在DN小鼠腎臟和MPC5細(xì)胞中的激活（圖11A-B）。

此外，精脒處理也減弱了這些通路的激活（圖11C-D）。重要的是，當(dāng)通過PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)時(shí)，MHD、MHD-D和精脒對(duì)自噬的影響被抵消（圖11E-F）。

糖尿病腎?。―N）是糖尿病最嚴(yán)重和致命的并發(fā)癥之一，可能導(dǎo)致需要透析或腎移植的終末期腎病。目前的治療策略主要集中在癥狀管理上，如控制高血糖、高血壓和蛋白尿，但這些方法不足以阻止DN的進(jìn)展，使得DN的管理具有挑戰(zhàn)性。越來越多的研究表明，中醫(yī)藥（TCM）在DN治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在此，我們發(fā)現(xiàn)MHD通過不同的機(jī)制保護(hù)DN小鼠的腎功能。首先，MHD可能通過激活足細(xì)胞自噬直接保護(hù)腎功能，從而減輕腎臟炎癥和纖維化。其次，MHD導(dǎo)致腸道菌群組成和微生物代謝物（尤其是精脒）的有益變化，而精脒有助于激活足細(xì)胞自噬。我們認(rèn)為，這兩條途徑可能共同促進(jìn)MHD的治療效果，其中細(xì)胞信號(hào)介導(dǎo)的直接腎臟效應(yīng)和腸道菌群調(diào)節(jié)影響全身代謝和炎癥反應(yīng)（圖12）。我們的發(fā)現(xiàn)為中醫(yī)藥管理DN提供了新的見解，并為MHD在未來DN治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

MHD在臨床實(shí)踐中已應(yīng)用三十多年，在各種疾病中顯示出良好的效果。在此，我們發(fā)現(xiàn)MHD治療改善了DN小鼠的代謝紊亂、胰島素抵抗和慢性炎癥。重要的是，MHD通過激活足細(xì)胞自噬和調(diào)節(jié)腸道菌群及其相關(guān)代謝物，減輕了糖尿病的常見并發(fā)癥DN的癥狀。有趣的是，MHD和MHD-D在改善DN方面表現(xiàn)出更顯著的效果，而達(dá)格列凈（DSR）的效果則較小。這種差異可能歸因于DSR在配方中的比例極小，僅為2.5%，只能在增加療效方面發(fā)揮補(bǔ)充作用，而非直接發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。此外，在MHD和MHD-D的表型效應(yīng)中未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，主要差異在于微生物組成。這一發(fā)現(xiàn)可能是因?yàn)镈SR的主要活性成分prim-o-glucosylcimifugin被認(rèn)為對(duì)修復(fù)腸道免疫屏障、調(diào)節(jié)腸道環(huán)境中微生物的豐度以及改善腸道菌群的組成具有顯著的調(diào)節(jié)作用。然而，我們僅通過LC?MS分析初步鑒定了MHD的活性成分，尚未確定可能有助于MHD在本研究中腎臟保護(hù)作用的具體生物活性物質(zhì)。未來的研究可以利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測MHD中的關(guān)鍵活性成分，并通過分子對(duì)接驗(yàn)證這些預(yù)測活性成分對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合親和力，以提供更多關(guān)于MHD作用和機(jī)制的詳細(xì)信息。

胰島素抵抗和代謝紊亂是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要因素。在DN患者中，胰島素抵抗阻礙了血糖的有效攝取和利用，而長期高血糖又會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝紊亂。我們發(fā)現(xiàn)，MHD治療增強(qiáng)了DN小鼠的胰島素信號(hào)通路，并改善了肝臟和eWAT中改變的脂質(zhì)代謝。這一結(jié)果可能是因?yàn)镸HD中黃芪的關(guān)鍵活性成分（如黃芪苷II和黃酮）可能增加胰島素與其受體的結(jié)合并提高受體活性，從而實(shí)現(xiàn)胰島素信號(hào)的有效下游傳遞。隨后，AKT磷酸化的調(diào)節(jié)激活了胰島素信號(hào)通路，促進(jìn)葡萄糖代謝并降低血糖水平。此外，黃芪苷II和黃酮可以促進(jìn)脂肪酸氧化，抑制脂肪酸在體內(nèi)的積累，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。黃芪調(diào)節(jié)糖脂代謝的精確機(jī)制尚不清楚。有趣的是，在MHD治療后，ACC和CPT-1α的表達(dá)水平顯著降低。因此，我們假設(shè)MHD可能通過AMPK/ACC/CPT-1α途徑（一條著名的脂質(zhì)代謝途徑）發(fā)揮作用，這有待進(jìn)一步研究。

炎癥和纖維化在糖尿病腎損傷的進(jìn)展中起著關(guān)鍵的加速作用。大量研究明確表明，炎癥貫穿于DN的發(fā)展過程中，并對(duì)導(dǎo)致腎臟損傷至關(guān)重要。DN小鼠的腎功能受損，炎性細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-1β）可以增加TGF-β的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)展。在本研究中，除了減輕肝臟、脂肪組織和結(jié)腸的炎癥外，MHD治療還顯著減輕了腎臟的炎癥和纖維化。MHD的這些抗炎和抗纖維化作用可以歸因于其主要活性成分。例如，來自黃芪的黃芪苷II、黃酮、染料木素和毛蕊異黃酮；來自當(dāng)歸的meranzin hydrate；以及來自DSR的cimicifugoside、5-O-甲基維薩米奧醇和二氫香豆素。這些成分降低了與炎癥和纖維化相關(guān)的因子的表達(dá)。此外，這些成分可能直接阻礙IκB激酶（IKK）的活性，阻止IκB的磷酸化和隨后的降解，確保NF-κB不會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以啟動(dòng)炎性基因的轉(zhuǎn)錄，從而最終緩解糖尿病引起的腎臟損傷。

腸道?腎臟軸引起了越來越多的關(guān)注。在DN患者中，腸道菌群發(fā)生了顯著變化，有益菌的豐度減少，有害菌的豐度增加。這種失衡導(dǎo)致緊密連接和粘附蛋白的表達(dá)減少，最終導(dǎo)致腸道屏障的破壞。受損的腸道屏障可以促進(jìn)細(xì)胞移位和感染。這一過程反過來通過腸道內(nèi)毒素和細(xì)菌素觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放，從而加劇DN的進(jìn)展。我們的研究表明，MHD治療保護(hù)了腸道屏障并減輕了DN小鼠的結(jié)腸炎癥。研究表明，來自黃芪的多糖可以為腸道粘膜的修復(fù)提供營養(yǎng)支持，調(diào)節(jié)腸道粘膜細(xì)胞的增殖和凋亡信號(hào)，增加粘膜細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)，最終增強(qiáng)腸道屏障功能。此外，僵蠶、蟬蛻、當(dāng)歸和DSR等成分可以通過抑制NF-κB通路的活性或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來減輕腸道炎癥。這些生物活性化合物和成分的保護(hù)作用可能有助于MHD增強(qiáng)腸道屏障功能。

腸道菌群在DN的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，我們通過全長16S rRNA分析鑒定了四種與小鼠腎臟損傷指標(biāo)顯著相關(guān)的細(xì)菌種類。其中，Akkermansia muciniphila作為一種公認(rèn)的有益菌，具有最高的豐度，并已被證明可以顯著改善肥胖、1型和2型糖尿病、脂肪肝、腸道炎癥和各種癌癥等狀況。DN小鼠中Akkermansia muciniphila的豐度顯著降低，而在MHD治療后顯著增加，表明MHD的保護(hù)作用可能至少部分由這種有益菌介導(dǎo)。盡管文獻(xiàn)中尚未明確定義其他三種細(xì)菌的具體作用，但我們的分析顯示，Clostridium cuniculi和Desulfovibrio sp011039085與腎臟損傷指標(biāo)水平呈負(fù)相關(guān)，與腸道菌群代謝物精脒和亞精胺呈正相關(guān)，而Jeotgalibaca ciconiae則呈現(xiàn)相反的相關(guān)模式。因此，我們假設(shè)Clostridium cuniculi和Desulfovibrio sp011039085可能作為有益菌，有助于改善DN，而Jeotgalibaca ciconiae豐度的增加可能會(huì)加劇腎臟損傷。未來實(shí)驗(yàn)應(yīng)精心設(shè)計(jì)以驗(yàn)證這一假設(shè)。我們的結(jié)果表明，MHD可能通過DN小鼠的腸道?腎臟軸發(fā)揮其作用，但在人類和小鼠之間，腸道菌群的組成和功能以及飲食習(xí)慣存在顯著差異。因此，在小鼠模型中有效的治療在人類中可能不一定產(chǎn)生相同的結(jié)果，我們的發(fā)現(xiàn)不能直接應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。通過在小鼠中進(jìn)行額外的菌群移植實(shí)驗(yàn)，可以揭示MHD作用與菌群之間的因果關(guān)系。未來的臨床研究可以通過分析接受MHD治療的患者的糞便樣本，驗(yàn)證這些結(jié)果，為這種治療方法的臨床相關(guān)性提供更多見解。

通過代謝物分析，我們篩選出四種可能與MHD作用相關(guān)的代謝物。具體來說，L-谷氨酸是谷胱甘肽合成的前體，這是一種重要的抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)的自由基和氧化應(yīng)激產(chǎn)物。因此，L-谷氨酸可能通過增強(qiáng)抗氧化能力來減少氧化應(yīng)激對(duì)腎小管細(xì)胞和腎小管間質(zhì)的損傷，從而改善DN。研究表明，GABA可能通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，促進(jìn)β細(xì)胞增殖以改善胰島素抵抗和葡萄糖耐受，并發(fā)揮抗炎作用，從而改善DN。大腸桿菌、擬桿菌、梭菌等屬可以參與多胺代謝中的酶促反應(yīng)，并編碼相關(guān)酶以促進(jìn)多胺（如精脒和亞精胺）之間的轉(zhuǎn)化。精脒和亞精胺也被認(rèn)為是自噬激活劑，這些多胺可能通過激活自噬來減輕DN。同樣，我們的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了精脒對(duì)足細(xì)胞的自噬促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明，MHD對(duì)DN的治療效果可能與腸道菌群及其相關(guān)代謝物的修飾有關(guān)。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是自噬的重要機(jī)制之一。AKT活性受到多種上游信號(hào)通路的影響，包括胰島素、胰島素樣生長因子（IGF）、生長因子和細(xì)胞外信號(hào)。然而，不同受體或通路的激活可能導(dǎo)致不同器官中AKT活性的趨勢(shì)相反。這是因?yàn)?，在肝臟和脂肪組織中，AKT的主要功能是調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)合成。AKT活性的降低表明胰島素信號(hào)通路被抑制，導(dǎo)致肝臟葡萄糖攝取減少和脂肪細(xì)胞中過度積累。相比之下，在腎臟中，DN早期AKT的激活可能發(fā)揮保護(hù)作用，而長期過度激活A(yù)KT可能促進(jìn)腎臟炎癥和纖維化，從而加速腎衰竭。在我們的研究中，DN小鼠腎臟中AKT與下游mTOR信號(hào)通路一同被過度激活，導(dǎo)致自噬受到抑制。MHD本身和微生物代謝物精脒通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活足細(xì)胞自噬，這些效應(yīng)在PI3K信號(hào)被抑制后被抵消，突顯了這一通路在MHD介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用中的參與。

除了PI3K/AKT/mTOR通路外，其他通路也可能對(duì)MHD的作用和機(jī)制有所貢獻(xiàn)。例如，黃芪可以通過AMPK通路降低血糖，毛蕊異黃酮可以通過Nrf2/HO-1通路介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)，而prim-o-glucosylcimifugin可能通過NF-κB通路調(diào)節(jié)炎癥過程。盡管我們的發(fā)現(xiàn)沒有直接證據(jù)表明它們的參與，但我們認(rèn)為未來的研究必須調(diào)查這些通路，以更全面地了解MHD的作用機(jī)制。

目前DN的治療格局主要分為兩大方法，即中醫(yī)藥和西藥。西藥通常依賴SGLT2抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑等藥物來管理DN。然而，這些治療也可能引發(fā)嚴(yán)重的副作用，如咳嗽、血管性水腫和急性腎損傷。此外，盡管西藥對(duì)管理DN至關(guān)重要，但通常無法完全阻止疾病的進(jìn)展。相比之下，中醫(yī)藥通過辨證論治和多靶點(diǎn)干預(yù)，通過改善患者的癥狀和整體健康狀況提供更全面的方法。目前，臨床上可用的中醫(yī)藥處方包括黃連解毒湯、腎氣丸和當(dāng)歸補(bǔ)血湯。與這些中醫(yī)藥相比，MHD作為一種更平衡的草藥組合，具有其自身的優(yōu)勢(shì)，如祛風(fēng)、清動(dòng)脈、調(diào)節(jié)免疫和改善微循環(huán)。本研究強(qiáng)調(diào)了MHD在治療DN中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，即其對(duì)多種機(jī)制的多靶點(diǎn)效應(yīng)，可以通過多種方式保護(hù)腎臟并延緩疾病進(jìn)展。一般來說，MHD是耐受性良好的，由于其主要成分黃芪，可能會(huì)出現(xiàn)輕度胃腸道不適或過敏反應(yīng)等罕見副作用。這些副作用雖然不常見，但突顯了進(jìn)一步優(yōu)化治療策略的必要性。將MHD與西藥結(jié)合可能可以利用這兩種方法的優(yōu)勢(shì)，從而開發(fā)出更有效的DN治療方法。

【結(jié)論】

我們的研究揭示了MHD通過減輕胰島素抵抗、改善代謝紊亂，并在DN小鼠中通過減輕炎癥和纖維化發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。這些效應(yīng)部分是通過保護(hù)腸道屏障功能、改變微生物組成及相關(guān)代謝物以及激活足細(xì)胞自噬來介導(dǎo)的。這些發(fā)現(xiàn)為MHD在DN治療中的潛在臨床應(yīng)用提供了寶貴的見解。

【文章思路】

一、【科學(xué)問題】糖尿病腎病（DN）缺乏有效治療手段，而中藥復(fù)方MHD臨床有效但機(jī)制不明。

【切入點(diǎn)】探究MHD是否通過調(diào)節(jié)代謝、腸道菌群及自噬通路改善DN。

干預(yù)設(shè)計(jì)：

建立HFD+STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型（模擬人類DN進(jìn)展）。設(shè)置MHD高/低劑量組、MHD-D（去成分組）、陽性藥對(duì)照組（達(dá)格列凈等），排除非特異性效應(yīng)。

二、驗(yàn)證MHD的全身性改善效應(yīng)（確認(rèn)MHD對(duì)DN核心表型（代謝紊亂、腎損傷）的改善）

1.代謝方面（圖2-3）：

檢測血糖、胰島素抵抗（HOMA-IR）、脂代謝指標(biāo)（TG/TC）、肝臟/脂肪組織病理及脂代謝基因（Srebp-1c↓, Pparα↑）。

目的：證明MHD改善全身代謝紊亂，為后續(xù)聚焦腎臟保護(hù)提供基礎(chǔ)。

2.腎臟方面（圖4）：

檢測腎功能指標(biāo)（SCR/BUN）、腎臟病理（纖維化/炎癥）、相關(guān)通路蛋白（p65 NF-κB↓, α-SMA↓）。

目的：直接驗(yàn)證MHD的腎臟保護(hù)作用，銜接后續(xù)機(jī)制探索。