2025年4月22日，國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊Nature以“加速預(yù)覽（Accelerated Article Preview）”的形式在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所柳紅團(tuán)隊(duì)與上?？萍即髮W(xué)、清華大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所和重慶醫(yī)科大學(xué)等多家單位合作的題為“Substrate recognition and cleavage mechanism of the monkeypox protease, Core protease”的最新研究成果。該工作在國(guó)際上首次闡明了猴痘病毒核心蛋白酶（Core protease, CorePro）三維結(jié)構(gòu)，揭示了核心蛋白酶底物識(shí)別與催化的分子機(jī)制，通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)策略發(fā)現(xiàn)了具有高效酶抑制活性和廣譜抗正痘病毒活性（猴痘病毒、痘苗病毒）的先導(dǎo)化合物，并闡明其微觀作用機(jī)制。該系統(tǒng)性工作證實(shí)了正痘病毒的核心蛋白酶是一個(gè)全新的廣譜抗病毒藥物靶標(biāo)，為靶向核心蛋白酶開(kāi)發(fā)廣譜高效抗正痘病毒藥物提供了堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和良好的先導(dǎo)化合物。
猴痘病毒屬于正痘病毒屬（orthopoxvirus genus），該屬還包含3種已知的人畜共患病毒，分別是天花病毒（VARV）、痘苗病毒（VACV）和牛痘病毒（CPXV）。歷史上，人類與天花病毒斗爭(zhēng)了近千年，曾有數(shù)億人因天花病毒感染死亡。自1970年剛果民主共和國(guó)報(bào)道首例猴痘病例以來(lái)，猴痘病毒主要流行于非洲中部和西部，在非洲以外地區(qū)很少發(fā)現(xiàn)。2022年5月，猴痘病毒擴(kuò)散傳播至英國(guó)，并迅速席卷全球，截至2025年2月28日，全球131個(gè)國(guó)家和地區(qū)共報(bào)道了13.4萬(wàn)例猴痘病例，死亡291例。猴痘疫情分別于2022年7月23日和2024年8月15日兩次被WHO宣布為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件（PHEIC）。目前尚無(wú)具有明確療效的抗猴痘病毒藥物，因此發(fā)現(xiàn)和確證抗猴痘病毒新靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、低毒高效且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗猴痘病毒藥物具有重大意義，既可用于應(yīng)對(duì)當(dāng)前猴痘疫情，又可作為國(guó)家儲(chǔ)備藥以應(yīng)對(duì)未來(lái)正痘病毒暴發(fā)危機(jī)。
正痘病毒是一類包膜的雙鏈DNA病毒，復(fù)制過(guò)程中會(huì)編碼一種高度保守的核心蛋白酶（在痘苗病毒和猴痘病毒中稱為I7L，在天花病毒中稱為K7L），核心蛋白酶通過(guò)水解核心蛋白前體驅(qū)動(dòng)感染性成熟顆粒（IMV）的形成，在正痘病毒生命周期中發(fā)揮了重要作用，因此闡明其三維結(jié)構(gòu)和底物識(shí)別機(jī)制，并基于此開(kāi)展先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)研究具有重要意義。
研究團(tuán)隊(duì)成功解析了猴痘病毒核心蛋白酶的高分辨率三維結(jié)構(gòu)（圖1）。核心蛋白酶為二聚體，每個(gè)單體可分為N端結(jié)構(gòu)域NTD、催化結(jié)構(gòu)域CD和C端結(jié)構(gòu)域CTD。活性中心位于催化結(jié)構(gòu)域，包含一個(gè)特征的催化三聯(lián)體Cys328-His241-Asp258。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)高通量篩選策略發(fā)現(xiàn)泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64d具有潛在的核心蛋白酶抑制效果和抗猴痘病毒活性，但活性較弱。猴痘病毒核心蛋白酶與E64d的復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)其與活性中心附近一個(gè)非催化Cys237殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，未能完全占據(jù)底物結(jié)合口袋。
圖1 猴痘病毒核心蛋白酶的整體結(jié)構(gòu)、催化結(jié)構(gòu)域特征及二聚化模式
為了開(kāi)發(fā)更強(qiáng)效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制劑，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了猴痘病毒核心蛋白酶底物識(shí)別和催化機(jī)制的研究?；诤诵牡鞍酌柑烊坏孜颬25K序列，利用醛基替換切割斷裂的酰胺鍵設(shè)計(jì)了底物類似物I-G18，期望能夠與催化中心Cys328共價(jià)結(jié)合，模擬催化中間體的結(jié)構(gòu)特征。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)，成功解析了CorePro-I-G18復(fù)合物結(jié)構(gòu)（圖2）。與apo結(jié)構(gòu)相比，在底物的誘導(dǎo)下，核心蛋白酶活性中心會(huì)發(fā)生一系列構(gòu)象變化，暴露出催化活性中心，完成底物的水解。S1和S2口袋形成了特征性的狹長(zhǎng)空腔，僅可容納Gly（P1位）和Ala（P2位）等側(cè)鏈尺寸較小的氨基酸殘基，合理解釋了正痘病毒核心蛋白酶Ala-Gly序列識(shí)別專一性。
圖2 猴痘病毒核心蛋白酶的底物識(shí)別機(jī)制
以核心蛋白酶的底物識(shí)別機(jī)制為基礎(chǔ)，研究團(tuán)隊(duì)利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)策略設(shè)計(jì)合成了擬肽類抑制劑A1~A6，引入P1~P5片段分別占據(jù)核心蛋白酶S1~S5底物結(jié)合口袋，同時(shí)在P1位置連接親電彈頭warhead與催化中心Cys328殘基共價(jià)結(jié)合（圖3）?；钚詼y(cè)試發(fā)現(xiàn)A2~A6具有高效的猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性（IC50為44.9～100.3 nM），其中化合物A3活性最優(yōu)，IC50達(dá)到44.9 nM，較底物衍生的九肽醛I-G18提高7倍（I-G18的IC50為314 nM）。為了闡明酶抑制活性的差異，研究團(tuán)隊(duì)解析了A1、A3和A4與核心蛋白酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示三個(gè)化合物均可與催化中心的Cys328殘基共價(jià)結(jié)合，同時(shí)能夠較好地占據(jù)底物結(jié)合口袋，其中A3的P4片段F原子能夠與Asp194殘基形成額外氫鍵相互作用，合理揭示了A3酶抑制活性更優(yōu)的原因。抗病毒活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，化合物A3~A6具有較強(qiáng)的抗猴痘病毒活性（EC50為1.98～7.31 μM）和抗痘苗病毒活性（EC50為1.39～3.66 μM），具有廣譜性；同時(shí)表現(xiàn)出良好的安全性，CC50均大于200 μM。相較于九肽醛I-G18，擬肽類化合物的抗病毒活性顯著提高（I-G18在50 μM濃度下未顯示出抗病毒活性）。研究結(jié)果表明，A3~A6是良好的先導(dǎo)化合物，有望通過(guò)進(jìn)一步成藥性結(jié)構(gòu)優(yōu)化開(kāi)發(fā)出廣譜抗正痘病毒藥物。
圖3 核心蛋白酶抑制劑的設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)與作用模式研究
（a猴痘病毒核心蛋白酶抑制活性；b抗痘苗病毒活性；c抗猴痘病毒活性）
該研究工作獲得了教育部學(xué)科突破先導(dǎo)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、上海市重大傳染病和生物安全研究院、上海尚思自然科學(xué)研究院等項(xiàng)目的資助。上?？萍即髮W(xué)生物電鏡平臺(tái)、上海同步輻射光源、國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施等平臺(tái)為本工作提供了技術(shù)支持。
全文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41586-025-09014-x
柳紅課題組長(zhǎng)期致力于抗病毒藥物的研發(fā)，其中針對(duì)新冠病毒開(kāi)發(fā)的主蛋白酶抑制劑FB2001已進(jìn)入臨床II/III期研究，相關(guān)工作發(fā)表于國(guó)際頂級(jí)期刊Science（封面文章）和病毒學(xué)領(lǐng)域著名期刊Antivir. Res.；針對(duì)HIV開(kāi)發(fā)的CCR5拮抗劑塞拉維諾已順利完成臨床I期，相關(guān)工作發(fā)表于藥物化學(xué)領(lǐng)域頂級(jí)期刊J. Med. Chem.（封面文章）。此外，針對(duì)冠狀病毒、腸道病毒、流感病毒、諾如病毒、腺病毒等病原體開(kāi)展了創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)研究，多個(gè)先導(dǎo)化合物表現(xiàn)出高效的體內(nèi)外抗病毒活性和良好的成藥性，相關(guān)工作已發(fā)表于Signal Transduct. Target Ther.、J. Med. Chem.、Chem. Commun.、Eur. J. Med. Chem.、Viruses等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊。
來(lái)源：中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所
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