無(wú)電池納米流體細(xì)胞內(nèi)輸送貼片！
將治療藥物靶向輸送至內(nèi)臟器官，例如促進(jìn)愈合或凋亡，在多種疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，主流的輸送方式依賴于血液循環(huán)；然而，這種方式在效率、安全性和/或可控性方面存在顯著的局限性。
鑒于此，北京航空航天大學(xué)常凌乾教授、北京大學(xué)李默教授、伊利諾伊大學(xué)香檳分校Cunjiang Yu，香港城市大學(xué)于欣格教授報(bào)道了一種無(wú)電池、無(wú)芯片、柔性納米流體細(xì)胞內(nèi)輸送(NanoFLUID)貼片，該貼片可在目標(biāo)內(nèi)臟器官中提供增強(qiáng)型和定制化的有效載荷輸送。無(wú)芯片架構(gòu)和薄功能層的柔性特性有利于與內(nèi)臟器官的整合。納米孔-微通道-微電極結(jié)構(gòu)能夠安全、高效、精確地對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行電穿孔，與傳統(tǒng)的擴(kuò)散方法相比，這使其在相對(duì)低振幅脈沖(20V)下操作時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有效載荷的運(yùn)輸速度提高了約105倍。通過在多種體內(nèi)場(chǎng)景中評(píng)估NanoFLUID貼片，包括治療乳腺腫瘤和肝臟急性損傷以及模擬腫瘤發(fā)展，研究人員驗(yàn)證了其在器官靶向輸送方面的效率、安全性和可控性。NanoFLUID介導(dǎo)的基因庫(kù)體內(nèi)轉(zhuǎn)染也能夠有效篩選乳腺癌在肺和肝轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。通過這種方法，DUS2被鑒定為肺特異性轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)因素。因此，NanoFLUID代表了一個(gè)創(chuàng)新的生物電子平臺(tái)，可將有效載荷定向遞送至內(nèi)臟器官，以治療各種疾病并揭示生物學(xué)的新見解。相關(guān)研究成果以題為“A battery-free nanofluidic intracellular delivery patch for internal organs”發(fā)表在最新一期《nature》上，共同第一作者為北航Dedong Yin, 北醫(yī)三院Pan Wang, 西工大Yongcun Hao, 蚌埠醫(yī)科大學(xué)Wei Yue和北航Xinran Jiang。
【NanoFLUID設(shè)計(jì)與表征】
作者在一張厚度 50 μm、直徑 10 mm、質(zhì)量不足20 mg 的聚萘二酸乙二醇酯薄片上集成了一種完全柔性、無(wú)需電池的“納流體細(xì)胞內(nèi)遞送貼片”，能夠貼合小鼠乳腺或肝臟等輕微曲面的器官而不影響其運(yùn)動(dòng) 。遞送側(cè)采用“納米孔-微通道-微電極”三層結(jié)構(gòu)：600 nm 孔徑的聚碳酸酯膜、微通道儲(chǔ)液器以及金微電極陣列。有限元模擬顯示，納米孔可將外加電場(chǎng)集中至約 1.5 × 106 V m?1，使電泳驅(qū)動(dòng)的貨物傳輸速率較純擴(kuò)散提高約 105倍，而所用脈沖僅為方波 20 V、10 Hz、20 ms。背面線圈與齊納二極管整流器可在 12 MHz 射頻載波下收能，輸出 20 V（體外/肝臟實(shí)驗(yàn)）或 50 V（較厚組織），且在 3–5 cm 組織距離或 60° 靜態(tài)彎折條件下電壓保持穩(wěn)定，后者亦是器件的疲勞極限。圖 1展示了器件貼附于器官表面的整體照片（a/b），三層結(jié)構(gòu)示意（c/d），納米孔電穿孔原理圖（e）以及無(wú)線產(chǎn)生的 50 V 脈沖序列（g）。
圖 1. 用于在體內(nèi)器官內(nèi)進(jìn)行輸送的無(wú)電池 NanoFLUID 裝置
【NanoFLUID 體外共轉(zhuǎn)染效能】
在三種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（MCF-7、人間充質(zhì)干細(xì)胞MSC、鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RAEC）中，優(yōu)化方案（20V、20ms、2脈沖）可獲得>90%GFP陽(yáng)性率，而脂質(zhì)體法為65–75%，商用體積電轉(zhuǎn)化儀則<25%。一次性遞送四種熒光質(zhì)粒時(shí)，NanoFLUID處理細(xì)胞中約50%同時(shí)表達(dá)四個(gè)基因；脂質(zhì)體法僅9.4%，體積電轉(zhuǎn)僅0.8%。電穿孔亦將細(xì)胞外囊泡（EV）釋放量提升至近3×109 EV ml?1，比對(duì)照高約十倍，其中約一半EV封裝了轉(zhuǎn)染的mRNA/蛋白，可實(shí)現(xiàn)旁觀者細(xì)胞的二次轉(zhuǎn)染。圖2示意轉(zhuǎn)染流程（a）、單基因效率柱狀圖（b）、四色陽(yáng)性單細(xì)胞（c）、RT-PCR結(jié)果（d）、多基因表達(dá)分布（e–g）、EV產(chǎn)量（h）及EV-介導(dǎo)的二次轉(zhuǎn)染（i/j）。對(duì)于安全性與整體體內(nèi)效能，貼片植入于第四乳腺皮下21天無(wú)肉眼炎癥反應(yīng)，局部細(xì)胞因子水平正常，全血計(jì)數(shù)及血清生化亦未見異常；LPS處理組作陽(yáng)性對(duì)照。在肝臟實(shí)驗(yàn)中，20V脈沖可使約6%肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染而不升高ALT/AST，說明低場(chǎng)強(qiáng)足以避免深層組織損傷。遠(yuǎn)隔器官幾乎未檢測(cè)到非特異性熒光，與系統(tǒng)性病毒或脂質(zhì)體遞送相比顯著降低。
圖 2. NanoFLUID 增強(qiáng)體外多種基因的轉(zhuǎn)染
【NanoFLUID急性肝損傷治療】
在小鼠肝裂傷模型中，比較5種處理：空白、GelMA水凝膠、系統(tǒng)性脂質(zhì)體-EGF、GelMA+EGF及NanoFLUID+EGF（質(zhì)粒2mgkg?1）。NanoFLUID可即時(shí)止血并在7天內(nèi)實(shí)現(xiàn)100%生存率，空白對(duì)照為60%，脂質(zhì)體組70%。僅NanoFLUID-EGF與水凝膠-EGF組在第7天將ALT/AST恢復(fù)至基線。組織學(xué)顯示肝實(shí)質(zhì)平滑、Masson染色幾乎無(wú)膠原沉積，Suzuki壞死評(píng)分平均0.2（其他組1.5–4.0）。圖3匯總實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸（a）、Kaplan-Meier生存曲線（b）、肝功能曲線（c/d）、H&E與Masson切片（e）、纖維化定量（f）及Suzuki評(píng)分（g）。
圖 3. NanoFLUID 在急性創(chuàng)傷性肝損傷治療中的應(yīng)用
【NanoFLUID 原位乳腺腫瘤建?！?/b>
兩次遞送CRISPR/Cas9質(zhì)粒敲除Brca1與Trp53：周1流式檢測(cè)3%Brca1-KO、21%Trp53-KO、68%雙KO細(xì)胞。光片顯微定位表明GFP?前癌克隆遍布2.5mm厚腺體（b）。中位腫瘤潛伏期53周；15例NanoFLUID小鼠中6例出現(xiàn)可觸癌，而靜脈脂質(zhì)體僅2/15（P=2.4×10??）。彗星實(shí)驗(yàn)顯示雙鏈斷裂增加九倍，全基因組測(cè)序檢出7600處顯著拷貝數(shù)變異，接近人BRCA1突變?nèi)橄侔┑?300處，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)胚系GEMM的3311處。圖4給出單細(xì)胞KO分布（a）、3-D定位（b）、無(wú)瘤生存曲線（c）、IVIS成像（d）、組織學(xué)與γH2AX染色（e/f）、彗星定量（g）及基因組對(duì)比（h–j）。
圖 4. NanoFLUID 體內(nèi)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生原發(fā)性乳腺腫瘤
【NanoFLUID原位乳腺腫瘤治療】
對(duì) ~70 mm3 的 E0771 Brca1/Trp53-KO 腫瘤，連續(xù) 3 周遞送 FITC-尼拉帕利：口服灌胃（50 mg kg?1 d?1）、單次腫瘤內(nèi)注射、可降解緩釋膜（45 μg）或NanoFLUID （6 × 10? ng g?1，每 3 天一次）。10 min 內(nèi) NanoFLUID 使 ~35 % 腫瘤細(xì)胞含藥，而腫瘤內(nèi)注射僅 ~12 %，口服/緩釋膜 < 5 % ；組織切片證實(shí) NanoFLUID 12 h 內(nèi)保持最高滯留 。PK 顯示每次脈沖均維持 ≥ 6 × 10? ng g?1 的谷濃度，而緩釋膜 21 天中有 10 天低于最低有效水平 。結(jié)果 NanoFLUID 將平均腫瘤體積縮至 ~150 mm3，空白為 ~500 mm3，其他遞送方式約 350–400 mm3（P = 2.05 × 10?12） 。僅口服組現(xiàn)全身毒性—體重下降 15 %、血小板下降 60 %、ALT/AST 升高；NanoFLUID 組生理參數(shù)正常。圖 5展示方案（a）、快速攝取動(dòng)力學(xué)（b/c）、腫瘤生長(zhǎng)曲線（d）與質(zhì)量（e）、凋亡/增殖標(biāo)記（f）、安全性指標(biāo)（g–j）。
圖 5. NanoFLUID 輸送用于原位乳腺腫瘤治療
NanoFLUID 轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)基因篩選
利用其高共轉(zhuǎn)染能力，在可誘導(dǎo) PyVmT 小鼠原位遞送含GFP 的 50 個(gè)不良預(yù)后基因 piggy-Bac 文庫(kù)。1 周時(shí)所有基因僅見于乳腺細(xì)胞，肺/肝均為陰性，說明空間控制精準(zhǔn) 。第 9 周 7/8 文庫(kù)小鼠出現(xiàn)轉(zhuǎn)移（肺6 例，肝 5 例），空載組至 12 周仍 0/8 。對(duì)轉(zhuǎn)移灶 PCR/qPCR 揭示 11 個(gè)富集基因，其中 DUS2 最高，TPM 4 030，5/8單細(xì)胞基因組檢出 。單獨(dú)過表達(dá) DUS2 使轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)翻倍，同時(shí)敲低（人/鼠 shRNA）將結(jié)節(jié)降低 > 60 %（P = 0.037） 。蛋白質(zhì)組學(xué)表明 DUS2 上調(diào) 76 種參與Rho-GTPase 信號(hào)、黏附斑及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的蛋白，推動(dòng)侵襲 。圖 6包括篩選流程（a）、基因存在熱圖（b）、單細(xì)胞多基因裝載（c）、無(wú)轉(zhuǎn)移生存曲線（d）、IVIS/H&E 示范（e/f）、結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)（g）、富集熱圖（h/i）、轉(zhuǎn)譯實(shí)驗(yàn)（j–m）及 DUS2 功能增/減實(shí)驗(yàn)（o–r）。
圖 6. 通過 NanoFLUID 介導(dǎo)的基因庫(kù)傳遞篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)基因
【總結(jié)】
通過巧妙的“納米孔-微流體-微電子”架構(gòu)，NanoFLUID能以20–50V無(wú)線脈沖在活體器官實(shí)質(zhì)中原位穿孔并電泳推進(jìn)帶電貨物，實(shí)現(xiàn)亞毫米級(jí)精準(zhǔn)遞送。平臺(tái)在體外可獲得>90%多基因轉(zhuǎn)染效率，體內(nèi)可止血并修復(fù)致命肝裂傷，構(gòu)建基因組特征貼近人病的BRCA1/TP53-突變?cè)荒[瘤，并在PARP-抑制劑遞送中優(yōu)于系統(tǒng)或被動(dòng)局部療法而無(wú)全身毒性。其一次可并行遞送50種質(zhì)粒，10周內(nèi)成功篩出肺特異性轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)基因DUS2。綜上，NanoFLUID是一種多功能生物電子貼片，適用于器官定點(diǎn)治療、疾病模型構(gòu)建及高通量體內(nèi)基因?qū)W研究，有望解決深部、脆弱或難切除組織的多類棘手病癥。
來(lái)源：高分子科學(xué)前沿
聲明：僅代表作者個(gè)人觀點(diǎn)，作者水平有限，如有不科學(xué)之處，請(qǐng)?jiān)谙路搅粞灾刚?/p>
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