自噬是一種高度保守的溶酶體依賴的細(xì)胞降解途徑，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存至關(guān)重要。在DNA損傷條件下，自噬通過回收受損細(xì)胞成分，為DNA修復(fù)提供代謝支持，從而維持基因組穩(wěn)定性。DNA損傷可通過激活A(yù)MPK或ATR-CHEK1-RHOB通路抑制mTORC1，進(jìn)而啟動自噬。此外，ATM、TP53調(diào)控的SESN1/2以及PARP1參與激活A(yù)MPK以誘導(dǎo)自噬，而MAPK8則通過磷酸化BCL2破壞其與BECN1的抑制性相互作用，從而觸發(fā)BECN1依賴的自噬。
近日，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、生物醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院張敏教授發(fā)表在Cell Death And Differentiation上題為TRIM21-driven K63-linked ubiquitination of RBM38c, as a novel interactor of BECN1, contributes to DNA damage-induced autophagy的研究發(fā)現(xiàn)了一種靈長類特異的RNA結(jié)合蛋白RBM38的亞型RBM38c。RBM38c在DNA損傷響應(yīng)中被激活并發(fā)生泛素化，進(jìn)而促進(jìn)自噬的啟動。RBM38由五個外顯子組成，通過選擇性剪接產(chǎn)生三種亞型，其中RBM38c比a型多32個氨基酸，因包含額外的外顯子2。研究揭示了RBM38c在DNA損傷誘導(dǎo)的自噬中的關(guān)鍵作用，為理解自噬的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。
研究團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)RBM38c是RBM38的一個新型亞型，比RBM38a多32個氨基酸。通過免疫沉淀和質(zhì)譜分析，他們發(fā)現(xiàn)RBM38c可能與泛素相互作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)RBM38c而非RBM38a被泛素化，且第35位賴氨酸（K35）是泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明，這種泛素化主要是K63鏈接的，而非K48鏈接的泛素化。共表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示RBM38c形成細(xì)胞質(zhì)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，與K63泛素共定位，這與RBM38a的分散分布不同。
圖1 RBM38c的發(fā)現(xiàn)與泛素化特性
有趣的是，RBM38c點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)與自噬體顯著重疊，尤其是與早期自噬標(biāo)志物如ATG16L1和新月體標(biāo)志物ZFYVE1共定位，而與晚期自噬標(biāo)志物L(fēng)AMP2共定位較弱。自噬誘導(dǎo)劑Torin1能有效促進(jìn)RBM38c點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的形成。敲低RBM38c導(dǎo)致LC3B-II減少但SQSTM1增加，表明RBM38c在自噬中發(fā)揮作用。過表達(dá)RBM38c增加了LC3B-II水平并減少SQSTM1水平，而K35R突變體無明顯影響，這證明RBM38c的泛素化對自噬至關(guān)重要。
圖2 RBM38c與自噬的關(guān)系
研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷藥物如喜樹堿（CPT）或順鉑（CDDP）能增加RBM38c的mRNA和蛋白水平，這一轉(zhuǎn)錄激活依賴于TP53。此外，CPT或CDDP處理還增加了RBM38c的泛素化水平，質(zhì)譜分析鑒定出TRIM21和STUB1兩個潛在的E3泛素連接酶。進(jìn)一步研究證實(shí)TRIM21而非STUB1介導(dǎo)RBM38c的K63鏈接泛素化，TRIM21的PRY-SPRY結(jié)構(gòu)域與RBM38c的80-111氨基酸區(qū)域介導(dǎo)它們的相互作用。
圖3 DNA損傷對RBM38c的調(diào)控
DNA損傷條件下，RBM38c的泛素化增強(qiáng)了其與BECN1的相互作用。質(zhì)譜分析揭示RBM38c可能與BECN1相互作用，免疫共沉淀證實(shí)了它們的內(nèi)源性相互作用。BECN1的310-360氨基酸區(qū)域和RBM38c的180-225氨基酸區(qū)域介導(dǎo)它們的相互作用。重要的是，DNA損傷增強(qiáng)了RBM38c與BECN1的相互作用，但不增強(qiáng)RBM38a或RBM38c-K35R突變體與BECN1的相互作用，表明RBM38c的泛素化對這種相互作用至關(guān)重要。TRIM21表達(dá)增強(qiáng)了RBM38c與BECN1的相互作用，而在TRIM21敲除細(xì)胞中，DNA損傷不再增強(qiáng)二者的相互作用和共定位。
圖4 RBM38c與BECN1的相互作用
進(jìn)一步研究表明，RBM38c特異性地與ATG14而非UVRAG相互作用，表明它優(yōu)先與PtdIns3K-C1復(fù)合物相關(guān)聯(lián)。DNA損傷增強(qiáng)了RBM38c與ATG14和PIK3C3的相互作用和共定位，而K35R突變體則沒有這種效應(yīng)。RBM38c敲低顯著減少了BECN1與ATG14和PIK3C3的相互作用，DNA損傷誘導(dǎo)的BECN1與這些伙伴的共定位也被抑制。GFP-FYVE報(bào)告系統(tǒng)表明，DNA損傷增加了GFP-FYVE點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，表示PtdIns3P募集，而RBM38c敲低顯著減少了這種點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的形成。體外激酶試驗(yàn)證明，DNA損傷誘導(dǎo)的PIK3C3激酶活性受RBM38c表達(dá)調(diào)控，而TRIM21敲除抑制了DNA損傷誘導(dǎo)的內(nèi)源性RBM38c與PtdIns3K-C1的相互作用，降低了PIK3C3激酶活性。
圖5 RBM38c與PtdIns3K-C1復(fù)合物的相互作用
臨床樣本中的RBM38c表達(dá)與化療抵抗。最后，研究人員探討了RBM38c依賴的自噬在DNA損傷條件下的作用。CPT或CDDP處理降低了細(xì)胞活力，而RBM38c但非K35R突變體表達(dá)恢復(fù)了細(xì)胞活力，這種保護(hù)作用可被自噬抑制劑3-MA消除。RBM38c表達(dá)抑制了DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡，這也可被3-MA抵消。RBM38c敲低進(jìn)一步增加了DNA損傷誘導(dǎo)的cleaved CASP3和cleaved PARP1水平，表明凋亡增強(qiáng)。相反，RBM38c表達(dá)降低了cleaved CASP3水平，但3-MA處理抵消了這種作用。
圖6 RBM38c依賴的自噬在DNA損傷中的作用
在臨床肺癌樣本中，RBM38c表達(dá)與LC3表達(dá)呈正相關(guān)，與化療抵抗相關(guān)。相比化療敏感患者，化療抵抗患者表現(xiàn)出更高水平的RBM38c和LC3表達(dá)，以及更低水平的cleaved CASP3，表明自噬增強(qiáng)而凋亡減少。相關(guān)性分析證實(shí)，RBM38c表達(dá)與LC3表達(dá)呈顯著正相關(guān)（rs = 0.466, P < 0.01），而與cleaved CASP3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（rs = -0.316, P < 0.01）。
圖7 臨床樣本中的RBM38c表達(dá)與化療抵抗
本研究鑒定出RBM38的新型亞型RBM38c，其在DNA損傷響應(yīng)中通過啟動自噬發(fā)揮關(guān)鍵作用。RBM38c通過促進(jìn)ATG14-PtdIns3K-C1復(fù)合物的組裝來激活自噬，且其功能依賴于TRIM21介導(dǎo)的K63鏈泛素化。DNA損傷通過TP53依賴性途徑上調(diào)RBM38c的表達(dá)，并增強(qiáng)其與BECN1的相互作用，從而促進(jìn)自噬復(fù)合物的形成，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡。RBM38c的32個額外氨基酸是靈長類動物特有的，且在臨床肺癌樣本中，其表達(dá)與自噬標(biāo)志物L(fēng)C3正相關(guān)，并與化療抵抗相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了RBM38c-TRIM21-BECN1軸在自噬調(diào)控中的新機(jī)制，并為癌癥治療提供了潛在的新靶點(diǎn)。
來源：南湖新聞網(wǎng)
編輯：吃一口小貓
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