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【寫在前面】：本期推薦的是由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示整合代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究香芍散結(jié)口服液治療大鼠乳腺增生的作用機(jī)制。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Integrating metabolomics and network pharmacology to explore the mechanism of Xiangshao Sanjie Oral Liquid in treating rats with mammary gland hyperplasia

民族藥理學(xué)相關(guān)性：香芍散結(jié)口服液（XSSJ）是一種傳統(tǒng)中藥方劑，臨床上用于治療乳腺增生（MGH），但其作用機(jī)制尚不明確。

研究目的：本研究旨在通過血漿代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的綜合策略，探討XSSJ對(duì)MGH的治療機(jī)制。

材料與方法：建立MGH大鼠模型，并采用多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行療效評(píng)估。隨后，通過代謝組學(xué)策略尋找可能在誘導(dǎo)MGH中起重要作用的血漿代謝物和代謝途徑。此外，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，鑒定XSSJ在大鼠血漿中的原型化合物及可能起效的靶基因。最后，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和西方印跡法（Western Blot，WB）對(duì)結(jié)果進(jìn)行整合和驗(yàn)證。

結(jié)果：XSSJ對(duì)MGH具有治療作用。通過代謝組學(xué)研究，鑒定了XSSJ在治療MGH過程中的29種差異代謝物。給予XSSJ后，在大鼠血漿中發(fā)現(xiàn)了16種原型化合物，這些化合物與179個(gè)潛在治療靶點(diǎn)相關(guān)。綜合分析表明，XSSJ可逆轉(zhuǎn)MGH大鼠中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表達(dá)。此外，不同劑量的XSSJ抑制了p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)。

結(jié)論：本研究結(jié)合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，揭示了XSSJ通過PI3K/AKT通路對(duì)MGH的調(diào)控作用，為進(jìn)一步支持XSSJ的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

（圖文摘要）

【前言】

研究目的：本研究旨在通過血漿代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的綜合策略，探討XSSJ對(duì)MGH的治療機(jī)制。

【結(jié)果】

1. XSSJ對(duì)MGH模型的藥效學(xué)結(jié)果

為評(píng)估XSSJ對(duì)MGH的影響，我們?nèi)鏅z查了幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，包括測量乳頭直徑和乳頭高度的變化，以及分析子宮指數(shù)和血清性激素水平。與NC組相比，MGH模型中乳頭直徑（圖_2B，p<0.01）、乳頭高度（圖_2C，p<0.01）和子宮指數(shù)（圖_2D，p<0.05）均顯著增加。相反，在用不同劑量的XSSJ治療后，乳頭高度、乳頭直徑和子宮指數(shù)呈劑量依賴性降低，接近NC組。

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，NC組乳腺組織無異常增生，腺泡數(shù)量極少，幾乎無擴(kuò)張，乳腺導(dǎo)管和管腔無分泌物（圖_2E）。MGH組乳腺組織顯著增生，乳腺小葉體積增大，腺泡數(shù)量增加，接近融合，腺泡和管腔擴(kuò)張且分泌過多（圖_2E）。然而，經(jīng)XSSJ治療后，MGH癥狀顯著改善，乳腺小葉體積、腺泡數(shù)量和管腔分泌均顯著減少。同時(shí)，MGH組血清中的雌二醇、孕酮和催乳素水平顯著升高（圖_2F、G、H，p<0.01，MGH與NC組相比）。經(jīng)不同劑量的XSSJ治療后，血清中的雌二醇、孕酮和催乳素水平顯著改善。

2. 代謝組學(xué)分析

通過使用QC樣品確認(rèn)了分析方法和儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。無監(jiān)督PCA結(jié)果顯示，所有QC樣品在評(píng)分圖上均在±2 STD范圍內(nèi)（圖_3A、B），表明整個(gè)分析過程中儀器穩(wěn)定性良好。

從代謝組學(xué)數(shù)據(jù)得出的主成分分析（PCA）圖顯示，MGH組與NC組之間有明顯分離（圖_3C、D）。這種清晰的分界表明MGH模型已成功建立，支持了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效性和兩組之間代謝譜的差異。此外，XSSJ-H組的位點(diǎn)與NC組有一定程度的重疊，表明兩組之間有顯著的空間關(guān)系。這種接近性與生物化學(xué)和組織學(xué)分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了觀察到的效果的有效性。這些結(jié)果表明，XSSJ-H組對(duì)MGH大鼠的代謝紊亂有積極影響，突出其潛在的治療價(jià)值。

采用監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型來識(shí)別正常對(duì)照（NC）組與乳腺增生組（MGH）之間的代謝變化，以及MGH組與XSSJ-H治療組之間的代謝變化。為評(píng)估模型性能，使用了參數(shù)R2Y和Q2。R2Y表示模型的擬合優(yōu)度，揭示模型對(duì)數(shù)據(jù)中變異的解釋程度；Q2評(píng)估模型的預(yù)測能力，反映其將發(fā)現(xiàn)推廣到獨(dú)立數(shù)據(jù)集的能力。結(jié)果顯示，R2Y和Q2的值接近1，表明OPLS-DA模型擬合適當(dāng)，在代謝組學(xué)變量評(píng)估中具有強(qiáng)大的預(yù)測能力（圖_4）。同時(shí)，進(jìn)行了200次置換檢驗(yàn)以評(píng)估OPLS-DA模型的穩(wěn)健性。分析顯示，所有計(jì)算出的Q2斜率均低于零，表明OPLS-DA模型沒有過擬合，如圖_4A2、B2、C2、D2所示，這證實(shí)了模型的可靠性和有效性。

3.3. 差異代謝物的篩選與鑒定

在代謝組學(xué)分析中，根據(jù)VIP>1和P<0.05的參數(shù)，我們篩選了NC組與MGH組之間以及XSSJ-H組與MGH組之間的差異代謝物。在NC組和MGH組之間共鑒定出67種差異代謝物。然而，XSSJ治療部分逆轉(zhuǎn)了雌激素和孕激素誘導(dǎo)的乳腺增生的代謝變化，消除了MGH大鼠的29種代謝變化，其中11種代謝物下調(diào)，18種上調(diào)。因此，這29種差異代謝物被確定為與MGH治療相關(guān)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。各組間生物標(biāo)志物的趨勢(shì)如補(bǔ)充表2所示。此外，我們制作了熱圖，以展示不同組間潛在生物標(biāo)志物相對(duì)豐度的差異，如圖_5A所示。分析顯示，NC組和MGH組在顏色表示上有顯著區(qū)別，而XSSJ-H組的顏色模式與NC組非常相似。這表明，XSSJ-H治療有效逆轉(zhuǎn)了這些代謝物的變化，突顯了干預(yù)措施的有效性。

4.我們使用MetaboAnalyst 6.0研究與XSSJ治療MGH相關(guān)的差異代謝物所調(diào)控的代謝途徑。在影響值>0.01的參數(shù)下，共富集到10條代謝途徑，其中6條被認(rèn)定為關(guān)鍵代謝途徑（圖_5B和補(bǔ)充表3），包括亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、初級(jí)膽汁酸生物合成、脂肪酸生物合成、類固醇激素生物合成（圖_5B和補(bǔ)充表3）。

5. XSSJ在血漿中的原型分析

通過文獻(xiàn)回顧、內(nèi)部數(shù)據(jù)庫、參考標(biāo)準(zhǔn)品和匹配MS/MS碎片規(guī)則，初步鑒定了XSSJ的原型化合物。通過UPLC-Q-TOF-MS在XSSJ中檢測到88種化合物，這些化合物在以往研究中已有涉及。其中，有16種原型化合物通過UPLC-Q-TOF-MS被明確鑒定出來。結(jié)果列于表2中，而大鼠血漿樣本在給予XSSJ后的總離子色譜圖如圖_6所示。

6. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

6.1. 原型成分及MGH的治療靶點(diǎn)獲取

給予XSSJ后，在血漿中鑒定出16種原型化合物，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行分析。將這些原型化合物上傳至TCMSP、HERB和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，共鑒定出468個(gè)與原型化合物相關(guān)的靶點(diǎn)。為了確定與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，以“乳腺增生”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，從GeneCards和OMIM等權(quán)威數(shù)據(jù)庫中提取了3695個(gè)與乳腺增生相關(guān)的靶點(diǎn)。通過維恩圖分析，發(fā)現(xiàn)原型化合物靶點(diǎn)與乳腺增生靶點(diǎn)之間有179個(gè)共同靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)被認(rèn)為是XSSJ治療MGH的潛在治療靶點(diǎn)（圖_7A）。

6.2. 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape軟件3.7.2構(gòu)建了16種原型化合物、179個(gè)潛在治療靶點(diǎn)和MGH之間的C-T-D網(wǎng)絡(luò)。如圖_7B所示，該網(wǎng)絡(luò)包含196個(gè)節(jié)點(diǎn)（16個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)和179個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1109條邊。黃色菱形代表原型化合物，藍(lán)色橢圓代表XSSJ在MGH治療中的潛在治療靶點(diǎn)，紅色八邊形代表MGH。節(jié)點(diǎn)的度值（即其連接數(shù)）反映了節(jié)點(diǎn)的重要性。其中，木犀草素的度值為40，在所研究的化合物中最高（補(bǔ)充表4），這表明木犀草素是治療MGH的主要活性成分，與之前關(guān)于木犀草素在乳腺癌治療中關(guān)鍵作用的研究一致。

6.3. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將179個(gè)潛在治療靶點(diǎn)整合到STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。去除未與網(wǎng)絡(luò)連接的節(jié)點(diǎn)后，PPI網(wǎng)絡(luò)由158個(gè)不同節(jié)點(diǎn)和617條連接邊組成（圖_7C）。然后使用CytoHubba插件篩選出中心基因（圖_7D）。確定的十個(gè)主要基因?yàn)楸砥どL因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（PTPN11）、磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基δ（PIK3CD）、雌激素受體1（ESR1）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基β（PIK3CB），這些基因被認(rèn)為是XSSJ在MGH治療中的中心基因。

6.4. GO和KEGG富集分析

使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，通過FunRich軟件對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。圖_7E-G顯示了在細(xì)胞組分（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）中排名前十的富集項(xiàng)。細(xì)胞組分主要包括血漿膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等；生物過程包括磷酸化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；分子功能包括蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等。KEGG富集分析排名前20的通路如圖_7H所示，主要涉及PI3K-AKT信號(hào)通路等，其中PI3K-AKT信號(hào)通路是最顯著富集的。值得注意的是，類固醇激素生物合成等通路也顯著富集，與血漿代謝組學(xué)分析結(jié)果部分一致。

7. 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-代謝物網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

為深入了解XSSJ在MGH治療中的作用，通過代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的協(xié)同分析，構(gòu)建了化合物-靶點(diǎn)-代謝物（C-T-M）網(wǎng)絡(luò)。在基因-代謝物關(guān)系分析中，將29種差異代謝物和179個(gè)潛在治療靶點(diǎn)輸入MetaboAnalyst 6.0，篩選后去除7種代謝物和82個(gè)無連接的潛在治療靶點(diǎn)，最終保留22種代謝物和97個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，并構(gòu)建了基因-代謝物（GM）網(wǎng)絡(luò)（圖_8A）。隨后，將16種原型成分、97個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和22種代謝物整合到Cytoscape 3.7.2中，構(gòu)建C-T-M網(wǎng)絡(luò)（圖_8B）。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的前十中心基因相交集，紅色橢圓代表與中心基因重疊的關(guān)鍵靶點(diǎn)。因此，EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11被確定為XSSJ治療MGH最相關(guān)的基因，并進(jìn)一步驗(yàn)證。

8. XSSJ對(duì)MGH中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11 mRNA表達(dá)的影響

通過RT-qPCR進(jìn)一步檢測乳腺組織中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表達(dá)水平。如圖_9所示，與NC組相比，MGH組中這些基因的表達(dá)顯著增加，而XSSJ處理顯著逆轉(zhuǎn)了這些關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)。這些結(jié)果表明，XSSJ可能通過調(diào)節(jié)EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11來緩解MGH。

9. XSSJ對(duì)MGH中PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平的影響

采用西方印跡法檢測PI3K和AKT蛋白的表達(dá)水平。如圖_10所示，與NC組相比，MGH組中p-PI3K和p-AKT蛋白水平顯著增加（P<0.01）。經(jīng)XSSJ處理后，p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平顯著降低，表明XSSJ可能通過調(diào)節(jié)PI3K和AKT蛋白的表達(dá)來減輕MGH。

10. 分子對(duì)接驗(yàn)證

采用分子對(duì)接Vina考察活性化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的潛在相互作用。將EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11五個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接，這些靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能和結(jié)合類型如表3所示，對(duì)接結(jié)果如圖_11A所示。一般來說，配體-受體結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，通常將結(jié)合能為?5.0 kcal mol?1視為基準(zhǔn)。以木犀草素和關(guān)鍵靶點(diǎn)為例，配體化合物與ESR1的氨基酸殘基W393和E353形成氫鍵（圖_11B），木犀草素在EGFR中形成兩個(gè)氫鍵，分別為K836和G833（圖_11C）。木犀草素和AKT1通過K268氫鍵相互作用（圖_11D），PTPN11和木犀草素結(jié)合到R362、W423、R465、G427、Q506和Q510的氫鍵網(wǎng)絡(luò)（圖_11E）。木犀草素和SRC通過K356氫鍵相互作用（圖_11F）。對(duì)接結(jié)果表明，XSSJ中的活性化合物對(duì)MGH的主要靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。

乳腺增生（MGH）是一種常見的乳腺疾病，給眾多女性帶來身體和情感上的困擾。此外，長期MGH可能增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)中醫(yī)理論，MGH的發(fā)生與激素失衡、肝郁、氣滯以及痰瘀血行問題密切相關(guān)。香芍散結(jié)口服液（XSSJ）具有平肝解郁、養(yǎng)血柔肝、活血化瘀、理氣止痛以及清熱散結(jié)的功效，與MGH的發(fā)病機(jī)制相契合。盡管XSSJ處方中的一些中藥已被證明對(duì)MGH具有臨床療效，但解釋XSSJ的作用機(jī)制仍是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，這主要是由于MGH病因復(fù)雜，以及中藥治療涉及多種化合物、靶點(diǎn)和途徑。在本研究中，采用大鼠模型評(píng)估了XSSJ對(duì)MGH的影響。給予XSSJ和他莫昔芬后，多種生化和病理指標(biāo)均顯著改善。這些藥效學(xué)結(jié)果為XSSJ治療MGH的應(yīng)用提供了有力支持。

在中藥研究領(lǐng)域，口服給藥是一種非常常見的給藥途徑。眾所周知，只有進(jìn)入血液循環(huán)的化合物才能發(fā)揮有效的藥理作用。為了篩選活性化合物，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)檢測XSSJ灌胃后大鼠血漿中吸收的原型化合物。最終成功鑒定了16種成分，包括木犀草素、甘草酸、橙皮苷、芍藥苷、丹參酸A、橙皮素等。雌激素和孕酮的失衡是乳腺增生發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)有研究表明，木犀草素能有效抑制雌激素合成過程，通過減少雌激素合成，可有效阻止雌激素依賴性細(xì)胞的異常增殖。橙皮素和橙皮苷能顯著影響雌激素信號(hào)通路中的基因表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。甘草酸和甘草次酸具有抗雄激素和雌激素樣活性，很可能在乳腺增生的病理過程中發(fā)揮重要作用。此外，丹參酸A、木犀草素、芍藥苷、橙皮素和原阿片堿等化合物均可作用于PI3K/AKT信號(hào)通路。通過阻斷PI3K/AKT通路，它們能抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而有效抑制乳腺增生。這些途徑和靶點(diǎn)與本文研究密切相關(guān)。盡管目前關(guān)于某些化合物在乳腺增生治療中的直接應(yīng)用研究相對(duì)較少，且大多數(shù)研究集中在乳腺癌等相關(guān)領(lǐng)域，但這些化合物的作用機(jī)制研究成果仍為乳腺增生的治療提供了極具價(jià)值的參考。

代謝組學(xué)是研究細(xì)胞和生物體代謝產(chǎn)生小分子的學(xué)科，這些小分子反映了生物系統(tǒng)中復(fù)雜的生化反應(yīng)結(jié)果。在MGH情況下，機(jī)體的代謝平衡可能改變，血漿代謝組學(xué)能夠捕捉到這些變化，為了解MGH的病理生理過程提供線索。過去的研究表明，影響MGH進(jìn)展的重要生物標(biāo)志物包括脂肪酸、氨基酸、膽汁酸、類固醇。在本研究中，共鑒定了29種差異代謝物，涉及多條代謝途徑。其中，初級(jí)膽汁酸生物合成和類固醇激素生物合成是XSSJ作用于MGH的關(guān)鍵代謝途徑。眾所周知，膽汁酸與膽固醇的合成、吸收和代謝密切相關(guān)。膽固醇作為雄激素合成的前體，間接調(diào)節(jié)雌激素的產(chǎn)生，從而對(duì)乳腺組織的各種生理和病理功能產(chǎn)生重大影響。通常，雌二醇水平升高常伴有膽汁酸水平升高。膽汁酸水平升高可直接促進(jìn)法尼醇X受體的表達(dá)，同時(shí)抑制雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致雌二醇水平進(jìn)一步升高，加重MGH程度。另一方面，在乳腺增生的發(fā)病機(jī)制中，膽汁酸代謝與PI3K/AKT信號(hào)通路之間的聯(lián)系不容忽視。許多研究文獻(xiàn)報(bào)道，各種膽汁酸能夠激活PI3K/AKT通路。在本研究中，我們關(guān)注初級(jí)膽汁酸生物合成，發(fā)現(xiàn)MGH大鼠中膽酸和甘氨膽酸水平顯著升高。根據(jù)Jiang等人和Mott等人的研究成果，膽酸和甘氨膽酸能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。值得注意的是，在本研究中，MGH大鼠的激素水平以及相關(guān)雌激素受體（ESR）及其下游PI3K/AKT基因的表達(dá)顯著升高。然而，經(jīng)XSSJ治療后，這些指標(biāo)顯著下降。這一結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了代謝組學(xué)在MGH中富集途徑的重要性。

然而，僅用代謝組學(xué)來解釋復(fù)雜的疾病機(jī)制和藥物作用機(jī)制相對(duì)困難，因?yàn)榇x變化可能是多種因素共同作用的結(jié)果，難以識(shí)別特定的靶點(diǎn)和信號(hào)通路。因此，需要結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)領(lǐng)域?yàn)橹兴幯芯刻峁┝诵碌囊暯呛头椒?。利用基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)視角，從分子水平上闡明了XSSJ治療MGH的機(jī)制。通過代謝組學(xué)治療調(diào)控，可以進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)識(shí)別關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)合可以將差異代謝物的靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)聯(lián)系起來，揭示疾病的干預(yù)機(jī)制。在本研究中，代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）和蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（PTPN11）是XSSJ治療MGH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

EGFR主要參與細(xì)胞的生長、增殖和分化。根據(jù)Lu等人的研究，激素水平的變化可能激活其表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K-AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。ESR1與激素有直接且密切的關(guān)系，是雌激素的主要受體之一。雌激素通過與ESR1結(jié)合，觸發(fā)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞生長、分化和凋亡等生理功能。例如，在乳腺組織中，雌激素與ESR1結(jié)合后可促進(jìn)乳腺細(xì)胞的增殖，這與MGH和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ESR1位于PI3K-AKT信號(hào)通路的上游，可通過SRC基因傳遞，從而激活PI3K-AKT信號(hào)通路。PTPN11可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的磷酸化狀態(tài)影響激素信號(hào)的傳遞，但這種關(guān)系并非直接的激素效應(yīng)。另一方面，PTPN11存在于細(xì)胞中，可直接作用于PI3K，通過去磷酸化影響PI3K-AKT通路，導(dǎo)致MGH。SRC在許多細(xì)胞信號(hào)過程中發(fā)揮作用，激素可能通過影響其他信號(hào)通路間接影響SRC的活性。已有研究表明，雌激素可能通過激活某些信號(hào)通路影響SRC的磷酸化狀態(tài)和活性，參與腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移等過程。此外，針對(duì)SRC激酶的抑制劑ZD6474能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的生長，其機(jī)制可能是通過上調(diào)E-鈣黏蛋白表達(dá)、下調(diào)β-連環(huán)蛋白表達(dá)以及削弱Snail啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。SRC可直接結(jié)合并激活PI3K。在此過程中，SRC通過磷酸化PI3K的調(diào)節(jié)亞基增強(qiáng)其脂質(zhì)激酶活性，促使其將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，可招募并激活A(yù)KT1。AKT1（絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶AKT）在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，激素可通過激活上游信號(hào)分子調(diào)節(jié)AKT1的活性。AKT1在ErbB2誘導(dǎo)的乳腺腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。AKT1缺乏會(huì)延緩腫瘤生長，減少肺轉(zhuǎn)移，并降低乳腺上皮腫瘤細(xì)胞的大小和增殖能力，同時(shí)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞的遷移和極性。AKT1促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖和葡萄糖代謝。綜上所述，這5個(gè)關(guān)鍵上游靶點(diǎn)在XSSJ對(duì)MGH的治療效果中發(fā)揮重要作用。

此外，根據(jù)KEGG富集分析結(jié)果，潛在靶點(diǎn)最顯著的富集通路是PI3K-AKT信號(hào)通路。5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)均與該通路相關(guān)。因此，采用西方印跡法檢測相關(guān)關(guān)鍵靶點(diǎn)（PI3K和AKT）的蛋白表達(dá)水平。如圖10所示，MGH組總PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平不變，而p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平較NC組升高。XSSJ處理顯著逆轉(zhuǎn)了雌二醇和孕酮聯(lián)合誘導(dǎo)的MGH中p-PI3K和p-AKT表達(dá)上調(diào)。

為深入探索XSSJ治療MGH的可能活性成分，將這些原型化合物與上述5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XSSJ血漿原型成分與MGH相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。這一發(fā)現(xiàn)意義重大，因?yàn)樗伙@了這五個(gè)上游靶點(diǎn)在介導(dǎo)XSSJ對(duì)MGH治療效果中的重要性。它們的高親和力表明，XSSJ與這些靶點(diǎn)的相互作用可能是該藥物治療這種疾病療效的基礎(chǔ)。

【結(jié)論】

本研究采用整合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，深入探究了XSSJ治療MGH的作用機(jī)制。通過綜合分析，確定了五個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和一條信號(hào)通路，即表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（PTPN11）以及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更好地理解XSSJ治療MGH的復(fù)雜分子機(jī)制，并為其臨床應(yīng)用提供了準(zhǔn)確可靠的依據(jù)。

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