世界衛(wèi)生組織（WHO）已批準(zhǔn)多種COVID-19疫苗用于緊急使用，這些疫苗基于多種平臺，例如mRNA疫苗、滅活病毒疫苗、蛋白亞單位疫苗和腺病毒載體疫苗。大多數(shù)疫苗選擇S原性和發(fā)揮作用的分子機制尚未完全闡明。
2025年3月19日，生命學(xué)院李賽課題組在《Structure》期刊發(fā)表了題為“Molecular basis of Ad5-nCoV vaccine-induced immunogenicity”的研究論文。該研究通過冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）、熒光顯微鏡和質(zhì)譜分析等技術(shù)，首次在分子層面揭示了兩種Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的結(jié)構(gòu)、分布和糖基化修飾信息。研究還在細(xì)胞水平上進(jìn)行了功能驗證，為疫苗的優(yōu)化和開發(fā)提供了重要的分子視角。
本項目研究了兩種疫苗，分別編碼了野生型新冠病毒S蛋白（Ad5-nCoV_Wu）和Omicron變異株+序列優(yōu)化的S蛋白（Ad5-nCoV_O）。研究團(tuán)隊首先對Ad5-nCoV疫苗接種細(xì)胞后誘導(dǎo)的S蛋白進(jìn)行了免疫熒光染色，對Ad5-nCoV腺病毒疫苗表達(dá)的S蛋白在細(xì)胞上的具體定位進(jìn)行分析，確認(rèn)了Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的S蛋白表達(dá)在細(xì)胞膜上。接著使用冷凍電子斷層成像（cryo-ET）技術(shù)對接種疫苗后的細(xì)胞進(jìn)行原位研究，在原位水平上觀察到Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白密集地呈現(xiàn)在細(xì)胞膜上，并且主要以融合前構(gòu)象（prefusion）存在。研究團(tuán)隊還觀察到，接種Ad5-nCoV疫苗的細(xì)胞能分泌出由S蛋白包被的囊泡。原位cryo-ET捕捉到了S蛋白包被囊泡的分泌過程中分別存在于細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外部的狀態(tài)（圖1）。這些由S蛋白包被的囊泡可以隨著體液運輸擴(kuò)大免疫范圍。
圖1 Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白冷凍電子斷層圖像
團(tuán)隊在細(xì)胞水平的研究中發(fā)現(xiàn)，Ad5-nCoV_Wu疫苗誘導(dǎo)的S蛋白在細(xì)胞膜上能夠介導(dǎo)細(xì)胞間融合，形成合胞體，而Ad5-nCoV_O疫苗由于2P突變和S1/S2切割位點的刪除，顯著減少了合胞體的形成，表明這些突變有效穩(wěn)定了S蛋白的前融合構(gòu)象，防止了細(xì)胞間融合的發(fā)生（圖2）。
圖2 Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白在細(xì)胞膜上的分布及合胞體形成
通過子斷層平均（sub-tomogram averaging）方法，團(tuán)隊解析了S蛋白的原位結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與天然SARS-CoV-2病毒上的S蛋白高度相似，S蛋白結(jié)構(gòu)完整且RBD結(jié)構(gòu)域具有靈活抬起和落下的特性（圖3）。
圖3 Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白原位結(jié)構(gòu)
為了在原位水平上驗證Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的免疫原性，團(tuán)隊使用特異性識別S蛋白的抗體對接種Ad5-nCoV_O疫苗的細(xì)胞進(jìn)行孵育并進(jìn)行免疫熒光觀察及cryo-ET數(shù)據(jù)收集。在原位上發(fā)現(xiàn)Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白可以被抗體識別并結(jié)合，具有良好的免疫原性（圖4）。
圖4 Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的免疫原性驗證。斷層圖像中紅色標(biāo)注為細(xì)胞表面的S蛋白密度，藍(lán)色標(biāo)注為識別S蛋白的抗體密度。
此外，團(tuán)隊通過質(zhì)譜分析，詳細(xì)解析了Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的糖基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的糖基化模式與天然SARS-CoV-2病毒上的S蛋白高度相似，尤其是Omicron株S蛋白的糖基化更為成熟，復(fù)雜型糖基化比例更高。這些糖基化修飾不僅有助于S蛋白的正確折疊，還可能影響其免疫原性，進(jìn)而影響疫苗的保護(hù)效果（圖5）。
圖5 Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的糖基化修飾
本研究通過使用cryo-ET技術(shù)，揭示了Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)疫苗能夠高效誘導(dǎo)S蛋白的表達(dá)，并且這些S蛋白具有高度的結(jié)構(gòu)完整性和免疫原性。這些發(fā)現(xiàn)為理解疫苗如何通過細(xì)胞呈遞抗原至細(xì)胞膜，并傳遞抗原至體內(nèi)從而激活免疫系統(tǒng)的過程提供了原位水平的視角。在細(xì)胞水平上對Ad5-nCoV疫苗引發(fā)的合胞體現(xiàn)象的研究，為疫苗的接種策略優(yōu)化提供了建議。然而，Ad5-nCoV疫苗誘導(dǎo)的S蛋白的具體免疫機制，尤其是其與中和抗體的結(jié)合機制、疫苗誘導(dǎo)的后續(xù)免疫反應(yīng)的分子機制等，是下一步的研究重點。
清華大學(xué)生命學(xué)院、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國家重點實驗室李賽副教授為本研究的通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2020級博士研究生董冬陽和博士后宋雨桐為本研究的共同第一作者。另外，李賽課題組2020級博士研究生彭程、2023級博士研究生張偉平、2021級博士研究生孔維正、科研助理張哲源、2023級博士研究生宋靜雯參與了部分工作。軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院研究員侯利華、吳詩坡與副研究員王步森為項目提供了腺病毒載體疫苗和寶貴的科學(xué)建議。
本工作得到了國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺、生物計算平臺、細(xì)胞影像平臺和公共生物安全二級實驗平臺的技術(shù)支持。同時，本研究得到了國家自然科學(xué)基金、清華大學(xué)春風(fēng)基金、清華大學(xué)篤實基金、清華-北大生命聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、膜生物學(xué)國家重點實驗室等支持。特別感謝雷建林博士、楊帆博士、李曉敏博士在冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集方面提供的幫助；感謝劉冰鈺博士、李靜博士在熒光成像方面提供的幫助；感謝鄧海騰博士、田曉林博士在質(zhì)譜樣品處理及分析方面提供的幫助。
原文鏈 接 ： https://www.cell.com/structure/fulltext/S0969-2126(25)00062-0
來 源：生命科學(xué)前沿
本期編輯：可愛晨
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