CRISPR-Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)推動(dòng)了基因組編輯的革命性發(fā)展，其中II型和V型系統(tǒng)應(yīng)用最廣泛。為對(duì)抗該防御機(jī)制，噬菌體進(jìn)化出Anti-CRISPR蛋白（Acr），目前已知5種V-A型AcrVA蛋白，其中AcrVA1和AcrVA5在煙草和水稻中證實(shí)能抑制LbCas12a與Mb2Cas12a核酸酶的編輯及調(diào)控活性。然而，不同AcrVA蛋白對(duì)其他Cas12a同源蛋白的抑制作用仍需深入研究。2025年3月27日，Plant Physiology雜志在線發(fā)表了西南大學(xué)張勇課題組題為Systemic evaluation of the inhibitory effects of 4 anti-CRISPR systems on different Cas12a nucleases in rice的研究論文。
該研究基于type V Acr蛋白與不同Cas12a同源蛋白，設(shè)計(jì)了type V型Acr蛋白和Cas12a核酸酶共表達(dá)策略的植物基因組編輯新系統(tǒng)，分析Acr蛋白對(duì)Cas12a植物基因編輯活性和特異性的影響，實(shí)現(xiàn)了水稻內(nèi)源基因高特異性有效編輯，進(jìn)一步豐富了植物基因組編輯工具庫。全文主要結(jié)果簡(jiǎn)述如下：
1. 4種Anti-CRISPR-Cas12a蛋白在大腸桿菌中的編輯表征
應(yīng)用質(zhì)粒干擾實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中研究不同Acr蛋白對(duì)AsCas12a和FnCas12a的抑制效果（圖1a）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于AsCas12a，AcrVA1顯示出最明顯的抑制效果，其次是AcrVA4，而AcrVA5和AcrC03在大腸桿菌中幾乎沒有顯示出任何抑制活性（圖1b）;FnCas12a被AcrVA1和AcrVA4強(qiáng)烈抑制，而AcrVA5和AcrC03蛋白在大腸桿菌中未能顯示出抑制活性（圖1c）。
圖1 多種Anti-CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的細(xì)菌編輯特性
2. Acr蛋白在水稻原生質(zhì)體中抑制FnCas12a、AsCas12a及Mb3Cas12a介導(dǎo)的基因組編輯
通過設(shè)計(jì)type V型Acr蛋白和Cas12a核酸酶共表達(dá)策略的植物基因組編輯新系統(tǒng)，分析Acr蛋白對(duì)Cas12a植物基因編輯活性（圖2a）。在水稻原生質(zhì)體中，共表達(dá)AcrVA1在全部六個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)顯著降低了AsCas12a的編輯效率，共表達(dá)AcrC03在四個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)顯著降低了AsCas12a的編輯效率，而AcrVA4和AcrVA5蛋白在所有目標(biāo)位點(diǎn)均未顯示明顯抑制效果（圖2b）。作者在相同的六個(gè)位點(diǎn)測(cè)試了AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5和AcrC03在水稻中對(duì)FnCas12a和Mb3Cas12a的多重編輯的抑制效果。與AsCas12a的情況不同的是，在水稻原生質(zhì)體中，AcrVA1和AcrVA4在六個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)均顯著抑制了FnCas12a的基因組編輯活性，且AcrVA4的抑制效果更強(qiáng),而AcrVA5和AcrC03的抑制作用較弱（圖2c）。對(duì)于Mb3Cas12a,AcrVA1在六個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)顯著抑制了Mb3Cas12a的基因組編輯活性，AcrVA4的抑制效果較弱,而AcrVA5和AcrC03對(duì)Mb3Cas12a核酸酶的編輯活性無顯著影響（圖2d）。這些數(shù)據(jù)表明，AcrVA1是廣譜強(qiáng)效抑制劑（對(duì)3種Cas12a均有效），與LbCas12a結(jié)果一致（He et al., 2024），而AcrVA4抑制效果具有變體特異性。
圖2 Acr蛋白有效抑制AsCas12a、FnCas12a和Mb3Cas12a植物基因組原位編輯
3. Acr蛋白在植物中阻止FnCas12a及Mb3Cas12a介導(dǎo)的基因組編輯及降低脫靶效應(yīng)
為驗(yàn)證不同AcrVA蛋白能否通過抑制Cas12a活性來降低基因組編輯的脫靶效應(yīng)（圖3a），作者在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻株系中測(cè)試了FnCas12a和Mb3Cas12a對(duì)六個(gè)靶位點(diǎn)的多重編輯效果。水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化結(jié)果分析顯示，F(xiàn)nCas12a在六個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了21.1%-63.2%的編輯效率。AcrVA1共表達(dá)后，在三個(gè)位點(diǎn)對(duì)FnCas12a編輯效率完全抑制，AcrVA4共表達(dá)后，在四個(gè)位點(diǎn)對(duì)FnCas12a編輯效率完全抑制，AcrVA5共表達(dá)后，有三個(gè)位點(diǎn)的編輯效率也有所下降，但程度較小，而當(dāng)AcrC03共表達(dá)后，對(duì)FnCas12a無顯著抑制作用（圖3b）。Mb3Cas12a在六個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了40.0%-80.0%的編輯效率。AcrVA1共表達(dá)后，在五個(gè)位點(diǎn)對(duì)Mb3Cas12a編輯效率完全抑制，AcrVA4、AcrVA5及AcrC03共表達(dá)后，有五個(gè)位點(diǎn)的編輯效率也有所下降，但程度較小（圖3c）。通過Cas-OFFinder預(yù)測(cè)crRNA脫靶位點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)分析顯示，在對(duì)照組植株中的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)到突變，而在AcrVA1/AcrVA4/AcrVA5共表達(dá)植株中均未檢測(cè)到脫靶編輯，說明Acr蛋白的表達(dá)能顯著降低FnCas12a和Mb3Cas12a在水稻中的脫靶效應(yīng)（圖3d和3e）。
圖3 Acr蛋白在水稻植株中降低靶向位點(diǎn)編輯效率及crRNA依賴性脫靶效應(yīng)
西南大學(xué)與西部（重慶）科學(xué)城種質(zhì)創(chuàng)制大科學(xué)中心聯(lián)合培養(yǎng)博士后何瑤博士、四川省食用菌研究所劉詩詩博士為論文共同第一作者，西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張勇教授、馬里蘭大學(xué)Yiping Qi教授為論文共同通訊作者。研究工作得到了國家科技創(chuàng)新2030－“農(nóng)業(yè)生物育種”重大專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資助。
論文鏈接：
https://academic.oup.com/plphys/article/197/3/kiaf097/8097899?utm_source=advanceaccess&utm_campaign=plphys&utm_medium=email
熱門跟貼