來源：醫(yī)科苑

1. 概念介紹

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核生物基因表達(dá)調(diào)控中重要環(huán)節(jié)。真核細(xì)胞 RNA 聚合酶自身對啟動子并無特殊親和力，單獨不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也就是說基因是無活性的。因此，轉(zhuǎn)錄需要眾多的轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄裝置。在基因轉(zhuǎn)錄起始階段，通用轉(zhuǎn)錄因子協(xié)助 RNA 聚合酶與啟動子結(jié)合，但其作用很弱，不能高效率地啟動轉(zhuǎn)錄。只有在反式作用因子 (基因特異性轉(zhuǎn)錄因子）的協(xié)助下，RNA 聚合酶Ⅱ和 TFⅡ才能有效地形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。

反式作用因子（trans acting factor）在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中具有特殊的重要性。它是能直接或間接地識別或結(jié)合在順式作用元件 8～12bp 核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)。這類 DNA 結(jié)合蛋白有多種，能特異性識別這類蛋白的序列也有多種，正是不同的 DNA 結(jié)合蛋白與不同的識別序列之間的空間結(jié)構(gòu)上的相互作用，以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)成了復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)。

在真核生物中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控是最重要，也是研究得最多的。蛋白質(zhì)相互作用在轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控方面具有重要的意義。細(xì)胞內(nèi)的反式作用因子都是處于有活性和無活性兩種狀態(tài)，這兩種狀態(tài)是可以轉(zhuǎn)換的。

反式作用因子處于無活性狀態(tài)時，與之相應(yīng)的基因就不能表達(dá)；反式作用因子處于有活性狀態(tài)、并與相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合時，就可以促進(jìn) RNA 聚合酶和通用轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的啟動子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。所以，真核基因的表達(dá)調(diào)控主要是調(diào)節(jié)反式作用因子的活性，隨后反式作用因子調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始。

轉(zhuǎn)錄因子被激活后，即可識別并結(jié)合上游啟動子元件和增強(qiáng)子，對基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用。大部分轉(zhuǎn)錄因子在激活以后與順式作用元件結(jié)合，但也可能有一些轉(zhuǎn)錄因子是先結(jié)合 DNA，被激活后才發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。增強(qiáng)子和上游啟動子元件可以結(jié)合一些相同的蛋白質(zhì)，在不同的基因中，存在著同樣的順式作用元件，這表明一些數(shù)量有限的基因調(diào)控蛋白控制著真核細(xì)胞的基因表達(dá)。

每一種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但是轉(zhuǎn)錄因子對基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一的因子完成的，而是幾種因子組合，發(fā)揮特定的作用。通常是幾種不同的轉(zhuǎn)錄因子控制一個基因的表達(dá)，一種轉(zhuǎn)錄因子也可以參與調(diào)控不同的基因表達(dá)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量是有限的，轉(zhuǎn)錄因子的組合作用方式使有限的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控不同的基因表達(dá)。

2. 研究思路

2.1 確定基因 B 啟動子轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域

2.1.1 擴(kuò)增基因 B 上游啟動子區(qū)

以基因 B 的轉(zhuǎn)錄起始位點為+1，擴(kuò)增基因 B 啟動子區(qū)（-1796bp 到+37bp），電泳結(jié)果顯示條帶特異，大小符合預(yù)期設(shè)計。接著用 DNA 回收試劑盒回收 PCR 所得擴(kuò)增片段，用內(nèi)部短引物鑒定 PCR 結(jié)果，電泳圖顯示這兩對引物均擴(kuò)增出位置正確的條帶，＿bp 和＿bp，提示擴(kuò)增的 1.8kbp 的片段確實為基因 B 啟動子。用 DNA 回收試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物得基因 B 啟動子（-1796bp 到+37bp）擴(kuò)增片段。

2.1.2 酶切 PCR 產(chǎn)物和 pGL3-Basic 質(zhì)粒

因在基因 B 啟動子擴(kuò)增的引物的兩端插入了 Nhe I 和 Hind III 酶切位點，故用 Nhe I 和 Hind III 限制性酶酶切后與 pGL3-promoter 載體上的 Nhe I 和 Hind III 粘性末端位點相連。

2.1.3 構(gòu)建 pGL3-Basic-基因 BP（-1761/+37） 質(zhì)粒 P（promoter）

將酶切的 PCR 產(chǎn)物連入 pGL3-Basic 質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，挑取單克隆，用基因 B 啟動子內(nèi)部引物鑒定，挑取鑒定正確的克隆 1、2、3、4、5 送測序。用 Vector NTI 10.0（Invitrogen）軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對。留取測序正確的菌株凍入-80℃ 保存。

2.1.4 不同長度的基因 B 啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

用構(gòu)建好的 pGL3-Basic-基因 BP（-1761/+37）為模板擴(kuò)增不同長度的片段，按上述的步驟連入 pGL3-Basic 質(zhì)粒，測序鑒定正確，-80℃ 保存。

2.1.5 雙熒光素酶報告系統(tǒng)確定基因 B 啟動子區(qū)核心區(qū)域

我們將成功構(gòu)建的基因 B 啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染 HEK-293 細(xì)胞，并同時轉(zhuǎn)入 pRL-TK 載體作為內(nèi)對照。48 小時后進(jìn)行熒光素酶報告基因分析。如圖所示：-1761、-1273、-1018、-644、-338、-217 六個不同長度的片段都能夠啟動基因 B 的轉(zhuǎn)錄，而-217 片段基本喪失轉(zhuǎn)錄活性，提示基因 B 的轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域就位于這段序列中。

運用 TRANSFAC 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)站我們發(fā)現(xiàn)在這 250bp 區(qū)域內(nèi)含有 4 個轉(zhuǎn)錄因子 A 的結(jié)合位點。那么具體是哪個位點對基因 B 的轉(zhuǎn)錄起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，然后我們又將這 250bp 的序列截成三部分，檢測其熒光報告強(qiáng)度。結(jié)果顯示當(dāng)將-108 到-42 這段序列截掉后，基因 B 的轉(zhuǎn)錄活性基本喪失，這說明基因 B 的轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域就位于在基因 B 啟動子-108 到-42 內(nèi)。這段區(qū)域決定了基因 B 約 70% 的轉(zhuǎn)錄活性。上述實驗結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子 A 可能通過-108 到-42kb 這 60bp 之間序列激活基因 B 的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。

注釋：如上是尋找轉(zhuǎn)錄因子與基因結(jié)合位點的套路方案，通過截短不同區(qū)域?qū)ふ业交钚躁P(guān)鍵區(qū)域。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子 A 對基因 B 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

2.2.1 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子 A 真核表達(dá)載體

將編碼轉(zhuǎn)錄因子 A 的基因序列連入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+) 后經(jīng)酶切鑒定，出現(xiàn)了＿bp 目的條帶，結(jié)果與前期設(shè)計相符，證明在真核表達(dá)載體中插入了相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子 A 蛋白編碼序列，命名為 pcDNA3.1-轉(zhuǎn)錄因子 A。

2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子 A 上調(diào)基因 B 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

2.2.2.1 體外證實轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合基因 B 啟動子

為了證明轉(zhuǎn)錄因子 A 可以結(jié)合到基因 B 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點，我們合成生物素標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點的寡核苷酸探針，提取 cell-1 細(xì)胞的核蛋白，體外進(jìn)行了 EMSA 實驗。結(jié)果顯示，加入核蛋白后可見明顯的遷移條帶，說明生物素探針可以和核蛋白結(jié)合，這種結(jié)合復(fù)合物可以被 100 倍未標(biāo)記的探針?biāo)偁幎黠@減弱。

同時我們也合成了突變轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點的生物素標(biāo)記探針，突變探針將不會結(jié)合核蛋白，說明遷移條帶確實是轉(zhuǎn)錄因子 A 和探針?biāo)纬傻?。為了進(jìn)一步證實轉(zhuǎn)錄因子 A 的結(jié)合，超遷移實驗顯示加入轉(zhuǎn)錄因子 A 特異性抗體后，出現(xiàn)明顯的超遷移帶，但是加入無關(guān)抗體并不出現(xiàn)此條帶。EMSA 實驗證明轉(zhuǎn)錄因子 A 可以特異地結(jié)合到基因 B 啟動子的轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點。

2.2.2.2 體內(nèi)證實轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合基因 B 啟動子

染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）檢測的是 活細(xì)胞狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件的結(jié)合情況， 近幾年來，該技術(shù)被廣泛用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究。用 ChIP 的方法檢測了基因 B 高表達(dá)的 cell-1 細(xì)胞和基因 B 低表達(dá)的 cell-2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子 A 的結(jié)合情況。用轉(zhuǎn)錄因子 A 抗體沉淀交聯(lián)復(fù)合體，然后經(jīng) RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)錄因子 A 在基因 B 啟動子上的結(jié)合序列。

結(jié)果顯示，加入轉(zhuǎn)錄因子 A 抗體后可以特異地沉淀基因組 DNA，通過 PCR 反應(yīng)可以特異性擴(kuò)增出基因 B 啟動子上的目的片段，而加入 IgG 的陰性對照未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。ChIP 實驗結(jié)果在體內(nèi)證實了轉(zhuǎn)錄因子 A 與基因 B 啟動子區(qū)的結(jié)合。同時我們也發(fā)現(xiàn)在基因 B 高表達(dá)的 cell-1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合到基因 B 啟動子的量明顯高于基因 B 低表達(dá)的 cell-2 細(xì)胞。這也從另一個方面說明轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合到基因 B 啟動子區(qū)，而且基因 B 的表達(dá)量越高其結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 A 的量也越高，轉(zhuǎn)錄因子 A 對基因 B 的表達(dá)調(diào)控可能起著上調(diào)的作用。

2.2.2.3 突變轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點顯著下調(diào)基因 B 轉(zhuǎn)錄活性

為進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)錄因子 A 通過結(jié)合基因 B 啟動子上-108 到-42 之間的轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點而激活基因 B 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點突變的基因 B 啟動子熒光報告載體，同時轉(zhuǎn)入 pRL-TK 載體作為內(nèi)對照。轉(zhuǎn)染 48 小時后進(jìn)行熒光素酶報告基因分析。結(jié)果顯示， 轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點突變的基因 B 啟動子熒光報告載體的轉(zhuǎn)錄活性與對照相比顯著下降， 這部分結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子 A 通過結(jié)合位于基因 B 啟動子上-108 至-42 之間的轉(zhuǎn)錄因子 A 結(jié)合位點，進(jìn)而激活基因 B 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子 A 對基因 B 轉(zhuǎn)錄激活作用

將野生型的 pGL3-基因 BP（-108/+37）與轉(zhuǎn)錄因子 A 真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)錄因子 A 質(zhì)粒用量的增加，基因 B 啟動子區(qū)的活性逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄因子 A 可以結(jié)合到基因 B 啟動子區(qū)并對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著上調(diào)作用。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子 A 參與基因 B 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

為了進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)錄因子 A 在基因 B 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的生物學(xué)作用，我們運用 RNAi 技術(shù)在基因 B 高表達(dá)的 cell-1 細(xì)胞中下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 A 的表達(dá)，然后觀察基因 B 的變化；反之在基因 B 低表達(dá)的 cell-2 細(xì)胞中通過瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子 A 真核表達(dá)載體過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 A，然后觀察基因 B 的變化。通過 RT-PCR 和 Western blot 的分析，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入 RNA 干擾片段后轉(zhuǎn)錄因子 A 的 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯下降，同時基因 B 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯被封閉。反之，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 A 可以顯著地升高基因 B 的表達(dá)水平。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄因子 A 參與基因 B 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且起著重要的作用。