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【寫在前面】：本期推薦的是由梅州醫(yī)學(xué)科學(xué)院、梅州人民醫(yī)院等研究團隊近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示甘草瀉心湯通過抑制ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡減輕實驗性結(jié)腸炎。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Gancao Xiexin decoction attenuated experimental colitis through suppressing ACSL4-mediated ferroptosis

民族藥理學(xué)相關(guān)性：甘草瀉心湯（GCXXD），由甘草、半夏、黃芩、生姜、人參、黃連、大棗組成，是一種用于治療潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的傳統(tǒng)中藥方劑。然而，GCXXD治療UC的潛在機制尚未完全闡明。

研究目的：潰瘍性結(jié)腸炎是一種以腸道屏障破壞為特征的慢性胃腸道炎癥性疾病。先前的研究表明，腸上皮細胞（IECs）中過度激活的鐵死亡會加重結(jié)腸的損傷和局部通透性異常。鐵死亡的主要機制之一是脂質(zhì)過氧化物，其依賴于長鏈?；o酶A合成酶4（ACSL4）來合成膜磷脂。最近的研究結(jié)果表明，GCXXD通過保護腸道黏膜屏障顯著減輕了潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的癥狀。因此，我們旨在證明GCXXD的藥理機制與ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。

材料與方法：在這項研究中，我們評估了GSE134025數(shù)據(jù)集，并建立了由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎實驗?zāi)Ｐ停?0 mg/kg的ACSL4抑制劑（羅格列酮）進行治療。通過結(jié)腸病理改變和阿爾西藍染色（用于顯示組織或細胞樣本中的酸性黏多糖 <如硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等> 及其他黏液物質(zhì)）來證實ACSL4抑制作為UC的潛在治療方法。隨后，我們檢查了GCXXD（9、12、15 g/kg）治療后UC小鼠的疾病癥狀、腸道黏膜修復(fù)和鐵死亡標志物。結(jié)腸組織的轉(zhuǎn)錄組研究揭示了GCXXD在治療UC方面的潛在機制。最后，我們在治療UC時聯(lián)合使用ACSL4上游激動劑和GCXXD，以證明GCXXD通過調(diào)節(jié)ACSL4誘導(dǎo)的鐵死亡來減少UC的炎癥。

結(jié)果：通過GSE134025數(shù)據(jù)集分析，我們發(fā)現(xiàn)ACSL4在UC患者中顯著表達，其抑制劑成功減輕了UC結(jié)腸的臨床癥狀。此外，我們發(fā)現(xiàn)GCXXD改善了結(jié)腸長度和體重，同時增加了黏蛋白（Mucin）、閉合蛋白（Occludin）和Claudin-1的表達。它還降低了結(jié)腸炎癥細胞浸潤以及IL-1β和TNF-α的水平。與此同時，GCXXD有效降低了結(jié)腸炎小鼠中與鐵死亡相關(guān)的指標，如丙二醛（MDA）、Fe2?、COX2和ACSL4，同時上調(diào)了GPX4的表達。通過對3% DSS和GCXXD治療組之間差異表達基因進行KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)了GCXXD治療與Hippo信號通路、花生四烯酸代謝之間的重要聯(lián)系。由于TEAD4作為ACSL4的上游轉(zhuǎn)錄因子，我們在治療UC時聯(lián)合使用GCXXD和YAP激動劑Py-60。值得注意的是，當(dāng)激活A(yù)CSL4上游通路時，GCXXD對腸道黏膜損傷和鐵死亡的抑制作用減弱。

結(jié)論：甘草瀉心湯通過TEAD4/ACSL4通路減輕UC中的鐵死亡。

（圖文摘要）

【前言】

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種持續(xù)性的非特異性胃腸道炎癥性疾病，主要影響乙狀結(jié)腸和直腸。目前，腸道黏膜完整性受損已被認為是UC的基礎(chǔ)病理生理機制，也是患者中主要的難治性因素。由于UC中的持續(xù)炎癥會直接破壞上皮細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，病原菌可以穿過受損的黏膜組織并刺激免疫細胞，從而導(dǎo)致腸道炎癥加劇。機體對腸道損傷的反應(yīng)涉及腸上皮細胞（IECs）的丟失和再生。然而，這一機制并不能解決UC患者黏膜損傷的修復(fù)問題。根據(jù)研究，在UC中發(fā)現(xiàn)了異常的程序性細胞死亡，導(dǎo)致腸道損傷增加和局部通透性問題。

鐵死亡是一種最近被識別的程序性細胞死亡形式，它在特定病理狀態(tài)下導(dǎo)致激活細胞的選擇性清除，并與多種胃腸道疾病密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者在腸上皮細胞中表現(xiàn)出鐵死亡的特征性形態(tài)，如線粒體收縮。而使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1已被發(fā)現(xiàn)能成功預(yù)防UC小鼠的潰瘍形成。脂質(zhì)過氧化物的形成在鐵死亡的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，其敏感性與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。研究表明，缺乏長鏈?；o酶A合成酶家族成員4（ACSL4）表達的細胞即使在GPX4被敲除的情況下也能保護自己免受鐵死亡的影響。ACSL4催化產(chǎn)生花生四烯酰輔酶A和腎上腺酰輔酶A，這些物質(zhì)通過LPCAT3重新酯化成類似于PE的磷脂，從而增強鐵死亡的敏感性。最近的研究顯示，UC患者結(jié)腸黏膜中ACSL4表達升高，而降低ACSL4水平已被證明可以緩解癥狀并預(yù)防UC動物的鐵死亡。靶向或降低ACSL4的轉(zhuǎn)錄活性作為干擾腸道鐵死亡和恢復(fù)腸道完整性的治療方法具有潛力。

作為一種傳統(tǒng)中藥，甘草瀉心湯（GCXXD）多年來常被用于治療包括結(jié)腸炎在內(nèi)的胃腸道疾病。根據(jù)研究，GCXXD在緩解或消除臨床癥狀、提高結(jié)腸病理改善以及展示更高的治愈率和更低的復(fù)發(fā)率方面優(yōu)于美沙拉嗪。GCXXD可以通過調(diào)節(jié)免疫功能來降低UC患者中促炎因子IL-6和IL-17的水平。最近的研究表明，GCXXD通過維持腸道黏膜屏障穩(wěn)態(tài)對UC具有顯著的治療效果，但其機制尚不清楚。因此，對其在治療UC中的具體作用機制進行更多研究是必要的。鑒于鐵死亡在腸道黏膜損傷中的重要性，我們推測抑制鐵死亡可能是GCXXD在UC治療中產(chǎn)生療效的機制之一。本研究將以ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡為切入點，探討其作為UC的潛在治療靶點，并以GCXXD為例，為解決UC的黏膜愈合問題提供新的思路。

【結(jié)果】

3.1. ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡參與UC發(fā)生發(fā)展

我們對比UC患者和正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GEO登錄號：GSE134025）后發(fā)現(xiàn)，UC患者中ACSL4及其他鐵死亡關(guān)鍵基因表達上調(diào)（圖1A和B）。同時，我們用ACSL4抑制劑羅格列酮（Doll等人，2017年）干預(yù)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠，發(fā)現(xiàn)該抑制劑可有效恢復(fù)UC小鼠的結(jié)腸長度（圖1C），緩解體重減輕（圖1D）和結(jié)腸組織潰瘍（圖1E），并增加小鼠結(jié)腸上皮細胞的黏蛋白分泌（圖1F）。這表明，靶向ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡可能是治療UC的潛在策略。

3.2. GCXXD緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的病理指標和組織損傷

既往研究表明GCXXD對UC患者有治療作用。本研究中，我們首先用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對GCXXD中的化學(xué)成分進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中含有多種主要活性成分，包括甘草素、黃芩素、人參皂苷Rg1、小檗堿、甘草苷元、氧化苦參堿、異甘草苷元和姜黃素（圖2A），補充材料（補充文件1）中有詳細數(shù)據(jù)。此外，我們采用3% DSS建立UC實驗?zāi)Ｐ?，同時給予GCXXD治療。11天后，3% DSS模型組的結(jié)腸縮短程度明顯大于正常組，而GCXXD給藥改善了結(jié)腸長度（圖2B），緩解了小鼠的腸道出血和腹瀉等癥狀（圖2C），減輕了結(jié)腸炎引起的體重減輕（圖2D）。蘇木精-伊紅染色的組織學(xué)檢查顯示，3% DSS處理的小鼠結(jié)腸炎嚴重，表現(xiàn)為上皮脫落和多形核白細胞浸潤到結(jié)腸固有層，而GCXXD治療似乎成功改善了這些癥狀（圖2E）。

3.3腸道黏膜的慢性炎癥可直接破壞上皮緊密連接結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，GCXXD可降低血漿中TNF-α、IL-1β等炎癥因子含量（圖3E和F），同時上調(diào)TGF-β（圖3G），還能恢復(fù)結(jié)腸組織中閉合蛋白、緊密連接蛋白1和黏蛋白的表達（圖3A-D）。

3.4. GCXXD減少ACSL4相關(guān)的鐵死亡發(fā)生

鐵死亡的過度激活對UC的黏膜組織愈合過程有顯著的不良影響。我們的實驗結(jié)果顯示，UC小鼠血清中丙二醛（圖4F）和COX2（圖4G）等鐵死亡標志物升高，但GCXXD治療可有效降低這些標志物。此外，GCXXD減少結(jié)腸中Fe2?含量（圖4A和B），抑制ACSL4表達并恢復(fù)UC小鼠結(jié)腸中GPX4蛋白水平（圖4C-E）。

3.5.GCXXD通過可能與Hippo信號通路相關(guān)的機制減少鐵死亡

為了探討GCXXD治療UC與鐵死亡之間的聯(lián)系，我們收集了正常組、3% DSS組和高劑量GCXXD組的結(jié)腸組織進行轉(zhuǎn)錄組分析。通過KEGG分析3% DSS組和GCXXD治療組之間的差異表達基因，我們發(fā)現(xiàn)GCXXD治療UC與鐵死亡、花生四烯酸代謝和Hippo信號通路之間存在聯(lián)系（圖5A-C）。有趣的是，GCXXD降低了結(jié)腸中ACSL4（圖5D）和TEAD4（圖5E）mRNA的表達。隨后，我們利用GEPIA數(shù)據(jù)庫研究了這兩個基因之間的相關(guān)性，結(jié)果表明ACSL4和TEAD4之間存在正相關(guān)關(guān)系（圖5F）。此外，結(jié)腸蛋白檢測數(shù)據(jù)顯示，GCXXD減少了結(jié)腸炎動物中ACSL4上游Hippo信號通路的激活（圖5G和H）。

3.6.GCXXD通過TEAD4/ACSL4通路減少鐵死亡

在這項研究中，我們使用YAP激動劑Py-60與GCXXD聯(lián)合應(yīng)用，以在UC小鼠中驗證轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果。聯(lián)合使用YAP激動劑和GCXXD降低了其在UC中的治療效果，表現(xiàn)為結(jié)腸長度和體重的恢復(fù)有限（圖6A和B）、血清TNF-α和MPO水平降低（圖6D和E）以及組織學(xué)指標改善（圖6C）。此外，激活Hippo信號通路，如活性YAP1進入細胞核或TEAD4表達升高（圖7A和B），限制了GCXXD對鐵死亡的抑制作用。聯(lián)合治療組并未降低結(jié)腸組織中的Fe2?（圖6F）和ACSL4水平，也未提高GPX4表達（圖7C-E）。這些數(shù)據(jù)表明，GCXXD通過TEAD4/ACSL4通路抑制鐵死亡。

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性、易復(fù)發(fā)的腸道炎癥性疾病，其特征是持續(xù)的炎癥、廣泛的潰瘍和結(jié)腸黏膜的破壞。根據(jù)流行病學(xué)研究，大約三分之一的重度UC患者會出現(xiàn)原發(fā)性硬化性膽管炎、壞死性皮炎、靜脈血栓等并發(fā)癥。由于其“炎癥”特性，UC的研究大多集中在免疫治療策略上，如抗TNF-α抗體等生物制劑的開發(fā)。盡管這些藥物在短時間內(nèi)改變了UC的治療格局，但仍有一小部分患者對現(xiàn)有治療反應(yīng)不佳。因此，了解UC的病理生理學(xué)并開發(fā)更有效的治療方法仍然是一個重要的科學(xué)問題。

UC發(fā)病早期以腸道屏障破壞和黏膜穩(wěn)態(tài)喪失為特征。臨床研究表明，成功的腸道黏膜修復(fù)有助于癥狀改善、降低手術(shù)風(fēng)險，并且是UC患者藥物治療的重要預(yù)后指標。腸道黏膜由四種上皮細胞組成：柱狀細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞。柱狀細胞構(gòu)成腸道上皮的絕大部分，其腔面有微小指狀突起，稱為微絨毛，被糖萼層包圍。這種黏液單層起到物理屏障的作用，防止腔內(nèi)致病菌進入腸道黏膜。一旦腸道屏障的完整性受損，大量腸道細菌會穿過腸道上皮屏障，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過度激活和異常的免疫及炎癥反應(yīng)。因此，這會破壞腸道黏膜免疫微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，最終促進潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展。因此，修復(fù)受損的腸道黏膜已被公認為UC治療的關(guān)鍵。

甘草瀉心湯（GCXXD）是一種中藥方劑，對UC的黏膜損傷具有預(yù)防作用。然而，其確切機制尚不清楚。GCXXD由甘草、半夏、黃芩、生姜、人參、黃連、大棗組成。這些植物名稱已在藥用植物名稱服務(wù)（MPNS）（http://mpns.kew.org）中得到驗證。在這項研究中，我們使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）鑒定了GCXXD中的典型物質(zhì)，如甘草素、黃芩素、人參皂苷Rg1、小檗堿、氧化苦參堿和姜黃素。然后我們建立了DSS誘導(dǎo)的UC模型，以評估GCXXD對UC小鼠的治療效果。結(jié)果表明，GCXXD不僅改善了UC癥狀，如體重減輕、結(jié)腸縮短和組織潰瘍，還恢復(fù)了緊密連接蛋白Occludin、Claudin 1和Mucin的表達。這些表明GCXXD對腸道損傷具有很強的修復(fù)作用。值得注意的是，腸道上皮細胞的更新速度是最快的，有助于腸道損傷的愈合。同時，調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、固有淋巴樣細胞（ILCs）和巨噬細胞衍生的細胞因子，如IL-10、IL-22和TGF-β，可以促進腸道上皮細胞的黏液分泌和RegIIIβ、RegIIIγ抗菌肽的表達，并誘導(dǎo)腸道干細胞的增殖，通過信號傳導(dǎo)增強屏障修復(fù)。盡管如此，黏膜修復(fù)在UC中仍然是一個問題，可能是因為上皮損傷未能成功緩解或預(yù)防，從而加劇了腸上皮細胞（IEC）的脫落。

臨床研究表明，錯誤或過量補充鐵可能會增加UC惡化的風(fēng)險。通常認為鐵可以通過芬頓反應(yīng)導(dǎo)致活性氧（ROS）積累，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化物的分解會產(chǎn)生4-羥基壬烯酸和丙二醛，這可能導(dǎo)致細胞膜中蛋白質(zhì)和核酸的異常共價改變，從而激活細胞的鐵死亡機制。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷鐵死亡的IEC會產(chǎn)生如HMGB1等損傷相關(guān)分子模式，這會顯著激活先天免疫系統(tǒng)，增加IEC脫落和腸道高通透性。抑制鐵死亡可能有助于UC動物腸道黏膜完整性的恢復(fù)，這表明過度的鐵死亡激活可能是腸道損傷修復(fù)的重要障礙。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)GCXXD可以成功降低UC小鼠中鐵死亡標志物如Fe2?、COX2和MDA的含量。此外，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果也證明了GCXXD治療UC與鐵死亡有關(guān)。因此，我們希望繼續(xù)研究GCXXD抑制鐵死亡的可能機制。

谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）途徑是調(diào)節(jié)鐵死亡的公認機制。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的作用是將磷脂鏈產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物還原為脂質(zhì)醇，從而降低腸道上皮細胞對鐵死亡的敏感性。研究表明，上調(diào)GPX4表達可以改善UC小鼠的結(jié)腸組織學(xué)損傷。脂質(zhì)過氧化被認為是脂質(zhì)代謝中的特異性過程，細胞脂質(zhì)和脂質(zhì)代謝在鐵死亡的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。作為鐵死亡的信號脂質(zhì)，PE-AA和PE-AdA的合成從脂肪酸酰基化開始。長鏈酰基輔酶A合成酶家族成員4（ACSL4）將輔酶A連接到多不飽和脂肪酸（PUFA）如花生四烯酸（AA）及其衍生物腺苷二磷酸（AdA），然后在溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（LPCAT3）的催化下與膜磷脂結(jié)合。PE過氧化產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基，包括磷脂過氧化自由基（PLOO?），引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)，最終導(dǎo)致鐵死亡。ACSL4已被確定為鐵死亡的關(guān)鍵基因，ACSL4介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝已成為鐵死亡的重要靶點。在回顧GSE134025的數(shù)據(jù)集后，我們發(fā)現(xiàn)ACSL4在UC患者的黏膜中表達顯著，ACSL4抑制劑在UC動物中有效。這表明，靶向ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡可能是治療UC的一種可行方法。

蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示，GCXXD可能會顯著抑制結(jié)腸中ACSL4的表達。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4產(chǎn)生的膜脂質(zhì)可以抑制GPX4的表達，促進腎細胞的鐵死亡。而GCXXD對GPX4的表達有有益影響。進一步研究GCXXD和3%DSS組之間的差異基因表達表明，GCXXD治療UC可能包括激活Hippo信號系統(tǒng)。由于沒有ACSL4激動劑，而TEAD4是ACSL4的上游轉(zhuǎn)錄因子，我們使用YAP激動劑Py-60與GCXXD聯(lián)合治療UC小鼠。有趣的是，通過激活Hippo通路增加ACSL4表達時，GCXXD的治療效果及其對UC的鐵死亡抑制作用被削弱。盡管本研究的結(jié)果已經(jīng)表明GCXXD通過抑制ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡有效治療UC，但需要考慮潛在的藥物脫靶效應(yīng)。因此，目前正在進行更嚴格的實驗，例如通過重組腺相關(guān)病毒將ACSL4/TEAD4基因遞送到腸道上皮細胞中。

【結(jié)論】

目前的研究已經(jīng)證明，GCXXD通過抑制ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡來治療潰瘍性結(jié)腸炎，恢復(fù)腸道上皮細胞的正常脫落和再生，并促進腸道黏膜屏障的自我修復(fù)（圖8）。